елементи

абстрактно

Блокадата на CC хемокини е привлекателна, но все още неизползвана терапевтична стратегия. Ние съобщаваме за in vivo фармакокинетиката на широкоспектърен ваксиничен вирус (35 K) ваксиничен вирус хемокинов протеин, слят с човешки IgG1 Fc. Ние показахме, че in vivo активността на протеин може да бъде разпитана, като се използва хидродинамично генетично доставяне на стандартен експресионен плазмид на бозайници. Високите плазмени нива на 35 K-Fc протеин се поддържат най-малко 14 дни след трансфера на гена, като протеинът все още се открива след 5 седмици. Потвърждаваме, че протеинът има биологична активност при остро възпаление, което причинява значително намаляване на набирането на моноцити по време на индуциран от зимозан перитонит. Способността на 35-K-Fc да блокира по-сложни патологии се демонстрира с помощта на аортни усвоявания за определяне на ангиотензин II-медиирано набиране на левкоцити в аортата. Ангиотензин II причинява повишено регулиране на mCCL2 в аортата, причинявайки натрупване на CCR2 + клетки. Пикът на набиране на моноцити в аортата настъпва в рамките на 3 дни и този процес зависи от CC хемокини, докато значително намалява чрез хидродинамично приложение на 35 K-Fc.

Хроничните възпалителни заболявания, като атеросклероза и ревматоиден артрит, са основна причина за смъртност и заболеваемост. Цитокините и хемокините са важни медиатори на възпалението при тези състояния и въпреки че има модулация на биологията на цитокините чрез биологични терапевтици като Etanercept, Fc-слят протеин, съдържащ TNF рецептора и по този начин действащ като рецептор на примамка, лицензираните хемокин-насочени терапевтици са много ограничен 1. Въпреки че антагонизмът CCR5 за блокиране на навлизането на ХИВ от Maraviroc е успешен, към днешна дата няма лицензирани лекарства, насочени към хемокини за хронично възпалително заболяване 2 .

Хемокините са малки разтворими протеинови медиатори, които регулират предаването на левкоцитите. Производството на тези молекули в местата на възпаление или инфекция контролира набирането на левкоцити. Когато този процес стане прекомерен или е неправилно иницииран, може да възникне хронично възпаление и патологично увреждане на тъканите 2. Много патогени експресират протеини, които улесняват имунното бягство на гостоприемника, като неутрализират аспекти на отговора на гостоприемника, като производството на хемокини 3. Вирусът на ваксиния кодира разтворим 35 kDa протеин, 35 K, който се свързва с всички човешки и миши CC-хемокини, обикновено при свързващи афинитети, по-големи от свързващите афинитети за свързване на естествен рецептор 4, 5, 6. По-рано показахме, че аденовирус или лентивирус-медииран трансфер на 35 K гена е ефективен при намаляване на атеросклерозата и болестта на венозната присадка 7, 8. Други групи съобщават за потискане на алергично възпаление върху кожата на морски свинчета и възпаление на дихателните пътища модели 5, 9. Докато доставянето на вируси е демонстрирало полезността на анти-СС хемокиновата блокада в предклинични модели на заболяването, то не е в състояние да се справи с проблемите с дозата и е малко вероятно да бъде одобрено за човешка терапия, ако се изисква трансфер на ген.

Fc-слетите протеини вече са добре установени като терапевтични средства с девет одобрени понастоящем от FDA 10. Добавянето на Fc домейн, човешки IgG1 в случай на лицензирани понастоящем Fc-сливания, има множество предимства при изграждането на нови биологични агенти. Fc домейнът е способен да се свързва с неонатални Fc рецептори (FcRn), които се експресират върху ендотелни, епителни и някои левкоцитни клетки. Свързването на молекулата с FcRn предпазва молекулата от лизозомно разпадане, вместо това молекулите се улавят през кладенци, покрити с клатрин, като същевременно се свързват с FcRn, което ги насочва към ендозомни отделения, които им позволяват да се върнат на клетъчната повърхност и да се върнат в циркулацията. 11. Това свойство има драматичен ефект върху серумния полуживот, като човешкият IgG има полуживот от 23 дни. Abatacept, сливан протеин CTLA-4 Fc, има полуживот повече от 10 дни 10 .

Fc-слитите протеини също улесняват пречистването на нови биологични продукти, позволявайки използването на стандартни технологии за пречистване на антитела и тяхното откриване за фармакокинетични изследвания чрез високо специфични реагенти за откриване на Fc 12. Въпреки че това може да улесни изграждането и производството на нови молекули в лабораторни мащаби, а не в промишлени условия, способността да се произвеждат големи количества протеини с минимално замърсяване с ендотоксини все още може да бъде скъпа и отнема много време. Комбинирахме малки експерименти с производството на протеини, за да демонстрираме еднодозовата фармакокинетика и системната бионаличност на нашия 35 K-Fc слет протеин, с хидродинамично доставяне на същия експресионен плазмид на бозайници, използван за производството на протеина, за да позволи ефикасността на протеините да бъде без първо трябва да се измислят многократни стратегии за дозиране или да се произвеждат големи количества високо пречистен синтетичен протеин. Използвайки хидродинамично приложение, ние демонстрирахме in vivo полезността на нашия CC-хемокин свързващ протеин, мутантът R89A 35 K-Fc, който демонстрирахме за първи път, е ефективен при остър модел на съдово възпаление.

Материали и методи

материали

Освен ако не е посочено друго, всички среди и буфери за клетъчни култури са получени от Invitrogen (Великобритания). Всички лабораторни химикали са от Sigma-Aldrich (Gillingham, UK), освен ако не е посочено друго.

Всички проучвания върху животни са извършени с етичното одобрение на Комитета за преглед на местната етика и в съответствие с Закона за животните (научни процедури) на Обединеното кралство от 1986 г. Мишките са настанени в индивидуално проветрявани клетки с 12-часов цикъл светлина/тъмнина и контролирана температура 20 ° С). С - 22 ° С). Стандартните фуражи (Harlan, Великобритания) и водата се предлагат ad libitum. C57bl/J мишки са закупени от Harlan UK или хомозиготни мишки B6.129P2-Apoe tm1Unc/J, които са били настанени на закрито, са използвани за експерименти.

35 Производство на K-Fc протеин и фармакокинетика

35 K-Fc протеинът се получава чрез трансфекция на експресионни плазмиди в 293T клетки и се пречиства чрез афинитет към протеин А, както е публикувано по-горе 13. Проведени са фармакокинетични проучвания чрез ip инжектиране на 5 μg 35 K-Fc протеин, последвано от перитонеална промивка и вземане на проби от плазмата по време на събиране. Перитонеалната промивка се получава чрез изплакване на перитонеума с 5 ml PBS/5 mM EDTA след смъртта.

Производство на 35 K-Fc инжекционни плазмиди

35 K-Fc и мутантни версии са получени във вектора pSecTag2 (C) (Invitrogen, Paisley UK), както беше публикувано по-рано 13. ДНК за инжектиране се приготвя, като се използва Maxi-prep ДНК комплект с нисък ендотоксин (Qiagen, Великобритания), използвайки пластмасов материал за еднократна употреба без пироген. ДНК на плазмидите се разтваря в вода без ендотоксини в тъканна култура, аликвотира се и се съхранява при -20 ° C. Нивото на замърсяване с ендотоксини се оценява с помощта на анализ на лимулирани амебоцити (QCL-1000) (Lonza, UK).

Хидродинамично доставяне

хемокин

5 μg от 35 K-Fc се инжектират ip в мишки C57bl/6J. Перитонеалната кухина се изплаква с PBS и плазмата се приготвя от мишки, събрани в продължение на 7 дни след инжектирането (n = 3 за времева точка). Концентрация от 35 K-Fc в перитонеалната промивка, изчислена като оставащото количество на животно ( A ) и плазмени концентрации ( Б. ) се определя чрез ELISA. Биоактивността на 35 K-Fc се определя чрез хемотаксичен биоанализ. Плазма (10%) се използва като хемоаттрактант в теста за хемотаксис в камерата на Бойден. Броят на клетките, мигриращи към плазмени проби, се изчислява, като индексът на миграция се нормализира до количеството на произволна миграция, наблюдавана само от буфера ( ° С ). RANTES плазмена концентрация 5 е измерена чрез ELISA ( д ). Плазмените концентрации на 35 K-Fc корелират с плазмената биоактивност ( Е. ). n = 3 за момент от време, статистически анализ, извършен чрез еднопосочен ANOVA и тест за множество сравнения на Dunnett. * стр

Мишките се инжектират с 1 или 10 ug от 35 K-Fc плазмид. Плазмата се събира 72 часа след инжектирането и се имунопреципитира с протеинови A/G. мъниста. Получените утаени протеини се идентифицират чрез Western blot, като се използват анти-Fc и анти-35 К антитела с пречистен 35 K-Fc като положителен контрол и инжектирани с физиологичен разтвор животни като отрицателна контрола ( A ). Мишките получиха хидродинамично доставяне на 1 μg от 35 K-Fc плазмид, отделни кохорти от мишки бяха събрани между 2 и 14 дни след инжектирането и изолирани плазмени и чернодробни проби (n = 3-5 за времева точка). Плазмените нива от 35 K-Fc са идентифицирани чрез ELISA ( Б. ) и съобщението 35 K-Fc беше оценено с помощта на специфични 35 K taq-man сонди в експеримент RT-PCR в реално време ( ° С ) (* стр

дискусия

Демонстрирахме in vivo полезността на нашите 35 K-Fc реагенти, за да тестваме ролята на CC хемокините в патологията. Ние показахме, че системното широкоспектърно инхибиране на CC-хемокините е ефективно за намаляване на набирането на миелоидни клетки в отговор на зимозанов перитонит. Ние също така демонстрирахме, че 35K-Fc може да блокира пристигането на моноцити в ранната фаза на AngII-задвижвано съдово възпаление и че се наблюдава преференциална блокада на моноцити, а не извличане на неутрофили. Освен това демонстрирахме полезността на нашата платформа за тестване на нови Fc-синтетични протеини, без да е необходимо да произвеждаме големи количества пречистен протеин. Предишната ни работа показа, че 35 K-Fc мутанти променят способността да блокират CC хемокини in vitro и локално in vivo, когато се доставят на мястото на възпалението. Сега демонстрирахме, че 35 K-Fc протеини имат добра еднодозова фармакокинетика, както и че имат системна активност при установени патологии, зависими от CC-хемокини.

Способността да се получат доказателства за биологична активност, без производството на големи количества протеин, дава възможност за по-бърз напредък и по принцип по-голям обхват от протеини, които трябва да бъдат скринирани за активност. Подобен инхибиращ хемокин вирус на ваксиния 35 K Fc слят протеин (vCCI), тестван в модел на индуциран от колаген артритис, изисква многократни дози от 200 μg, за да се демонстрира биологичен ефект 29. По време на експеримента това изисква доставяне на 2 mg протеин на мишка. Този режим на дозиране е свързан със загуба на ефикасност и генериране на силен анти-телесен отговор на vCCI-Fc в рамките на 14 дни след започване на лечението 29. Експресирахме 35 K лентивируси и наблюдавахме функционално инхибиране на болестта в продължение на поне 3 месеца, много по-дълго, отколкото беше постигнато с vCCI-Fc7. Ако производството на Fc-слят протеин предизвиква засилен имунен отговор, потенциално чрез производството на нео-антигени, това отново е нещо, което може да бъде скринирано за използването на модифицирани плазмиди, без да са необходими многодозови експерименти с използване на модифицирани протеини.

Мощните имуномодулиращи терапевтични средства, като инхибитори на TNFα, показват силно инхибиране на имунни заболявания, като ревматоиден артрит, но тяхната ефикасност може да бъде загубена с течение на времето, което изисква терапия от втора линия 30. Ефикасността на цитокини като TNFα и фамилията CC хемокини в основни имунни функции, като контрол на инфекциите, поражда реална загриженост относно ползата от ползата от благоприятните ефекти върху заболяването срещу компрометирането на способността на организма да контролира инфекции и рак. Успехът на терапиите с TNFα-Fc обаче показва, че добре наблюдаваните пациенти могат значително да се възползват от антицитокиновите терапии. Свързването на CC хемокини с толкова много хронични състояния като атеросклероза, артрит и стомашно-чревни заболявания показва, че CC-хемокиновите инхибитори, като нашите 35 K-Fc мутанти, могат да бъдат полезни и като експериментални инструменти за изследване на ролята на този клас молекула и като потенциални терапевтични агенти 2 .

Повече информация

Как да цитирам тази статия: McNeill, E. et al. Хидродинамично генетично доставяне на свързващи Fc Fc протеини за свързване на хемокини за насочване на острото съдово възпаление In Vivo. Sci. Представител. 5, 17404; doi: 10.1038/srep17404 (2015).