20 юни 2012 г., Автор на статията: Лазарова Катина, Лекарство
Том 5, номер 6 Добавяне на публикация

остеопороза

Ние считаме, че остеопорозата е многофакторно заболяване, което води до намаляване на качеството на живот, защото намаляването на здравината на костите води до намаляване на здравината на костите. Понастоящем научната общност обръща голямо внимание на анализа на кандидат-гени, които могат да корелират с развитието на остеопорозно заболяване. Това проучване се фокусира върху анализа на OPG гена.

1. Въведение

Остеопорозата е едно от най-често срещаните заболявания сред населението. Засяга предимно възрастните хора, двата пола и всички етнически групи. Остеопорозата се характеризира с намаляване на костната маса и нарушаване на микроархитектурата. Тези фактори водят до повишена честота на фрактури. Рисковете от остеопороза могат да бъдат модифицирани, в зависимост главно от начина на живот и фиксираните рискове, които са наследствени. [1]


Фиг. 1 Сравнение на костната маса на здравата кост и костите, засегнати от остеопороза [2]

2. Генетични предразположения към остеопороза

Както вече споменахме, остеопорозата е многофакторно заболяване, което засяга взаимодействието между влиянията на околната среда и гените, както и между самите гени. В много случаи е потвърдена връзката между генните полиморфизми, участващи в костния метаболизъм, и развитието на остеопоротично заболяване. Полиморфизмите в много гени корелират с появата на това патологично състояние. Това показват и резултатите от анализи от близнаци и семейни проучвания, които предполагат, че наследяването на КМП варира от 25% до 85%. Влиянието на наследствеността несъмнено играе решаваща роля в регулирането на костната маса и, освен в редки случаи, наследяването на КМП е полигенно. [1]

В рамките на генетичните предразположения, които могат да доведат до това патологично състояние, различаваме много гени. Една от причините може да са полиморфизмите в гена за OPG (ген, кодиращ остеопротегерин), VDR (ген, кодиращ рецептор на витамин D), LRP 5 (липопротеинов рецептор 5 протеин), полиморфизъм на гена COLIA (колагенов ген), TGF-β1 ген (ген, кодиращ трансформиращ растежен фактор), IGF-1 (ген, кодиращ инсулинов растежен фактор) и IL6 ген (ген на интерлевкин 6). [3]

OPG

OPG е идентифициран по време на проект за cDNA на плъх. Тази група изследователи се занимаваха с TNF-рецептора. OPG играе важна роля в остеобластогенезата. Неговият биологичен ефект е да инхибира активността и диференциацията на остеокластите. Тежка остеопороза е наблюдавана при мишки с целенасочена делеция на OPG гена. Значително по-ниска стойност на BMD на дисталното радио се наблюдава при индивиди, хомозиготни за рецесивния алел (GG) в сравнение с хетерозиготите и хомозиготите за доминиращия алел при SNP 245T/G и 163A/G. OPG и RANKL са свързани с появата на костни фрактури и КМП в гръбначния стълб и лумбалната област. [4]

Полиморфизъм A163G

Полиморфизмът A163G се идентифицира в областта на OPG промотора. Честотата на A163G полиморфизъм е значително преобладаваща при пациенти с фрактури на гръбначния стълб. В проучване на жени от Кавказка в постменопауза експертите разкриха връзка между полиморфизма A163G и честотата на лумбални и фрактури на китката. [5]


Фиг.2 Полиморфизми в проксималната област на OPG [4]

3. Материал и методика на работа

Изолиране на ДНК от кръв

В тази работа използвахме устни тампони и проби от периферна кръв, получени от пациенти с диагноза остеопороза, които бяха предоставени от Osteocentrum Prešov. EDTA се използва като антикоагулант в кръвни проби. Анализирахме 110 проби, спазвайки всички етични и правни стандарти, необходими за хода на изследването.

Материал и химикали за изолация:

За да изолираме ДНК от проби от периферна кръв, използвахме UltraClean® Blood DNA Isolation Kit (Non-Spin), който е предназначен да изолира геномна ДНК с високо молекулно тегло. Отделни химикали: буфер G1, G2, RNase A, G3, 100% изопропанол, 70% етанол, буфер G4. Материал и устройства: епендорфи, пипети, върхове на пипети, вихър, центрофуга Hettich Mikro 200R, термостат CH-100.

Процедура за въвеждане на PCR реакция в реално време:

  1. Химикали и материали за PCR в реално време:
    • Химикали:
      • TaqMan® Genotyping Master Mix, Приложни биосистеми от Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ,
      • TaqMan rs3102735; C___1971046_10, Приложни биосистеми от Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ
      • H2O от Milipor
    • Материал:
      • MicroAmp ™ Fast Optical 48-ямкова реакционна плака (0,1 ml), Applied Biosystems от Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ
      • Оптичен лепилен филм MicroAmp® с 48 ямки, Приложни биосистеми от Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ
      • пипети с различен обем, върхове за пипети
  2. Устройства:
    • Многофункционална центрофуга JOUAN B4i, шкаф за биологична безопасност клас Esco (BSC)
    • Система за PCR в реално време StepOne с прилагани компютърни системи за управление на биосистеми от Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ

PCR в реално време StepOne предоставя възможност за анализ на данни от различни гледни точки, използвайки многокомпонентен дисплей. Предимството на това устройство е, че то е в състояние да идентифицира пробата, респ. дупка в плочата, която може да повлияе неблагоприятно на целия анализ. Той е в състояние да открива багрила FAM, VIC, SYBR Green, ROX. StepOne определя позицията и интензивността на флуоресцентните сигнали, багрилата, свързани с всяка флуоресценция, и значимостта на всеки сигнал.

  • Дизайн на сонда и грунд:
    Използвахме сондата за усилване на желания участък от OPG гена: TaqMan rs3102735; C___1971046_10
    Местоположение: хромозома 8
    Организъм: Homo sapiens
    Родословие: Еукариота; Метазои; Хордата; Craniata; Гръбначни; Евтелеостомия; Бозайници; Евтерия; Euarchontoglires; Примати; Хаплорини; Катарини; Hominidae; Хомо
    контекст на последователността (VIC/FAM):
    CTCTAGGGTTCGCTGTCTCCCCCAT [C/T] AATTCCCTGGTCTAGAAGTTAGACT
    полиморфизъм: C/T предаване
    генен символ: TNFRSF11B OPG; TR1; OCIF (www.bioinfo.appliedbiosystems.com)
  • Параметри на отделни цикли:

    • преди PCR температурни цикли Post-PCR стъпка фаза задържане фаза 50 цикъла задържане фаза денатурация температура време събиране на данни
    60 ° С 95 ° С 92 ° С 60 ° С 60 ° С
    00:30 10:00 0:15 1:30 1:30
    Да не не Да Да

    4. Резултати и дискусия

    Анализираната група се състои от 110 лица с диагноза остеопороза. Анализирахме пробите, използвайки PCR метод в реално време. В това проучване изследвахме полиморфизма на OPG гена A163G, който най-често се описва във връзка с остеопороза.

    Раздел. 1 Среден възрастов състав на индивидите в анализираната група

    жени мъже
    брой лица в анализирания файл 101 9
    процент 91,8% 8,2%
    възрастова група 33-83. 47-79 р.
    средна възраст 64 r. 61р.

    Най-високата честота на поява в анализираната група е регистрирана при генотип АА с честота 74,55%. Открихме появата на GG генотип с честота 4,55%. Генотип AG е идентифициран в 20.90% от анализираните проби. Според закона на Харди-Уайнбърг разпределението на отделните генотипове е в равновесие, както е документирано от резултата от теста Хи-квадрат. Сравнявайки честотите на алелите, ние открихме по-висока честота на поява на алел А в анализирания набор, която се случи с честота от 0,85. Честотата на поява на алела G е 0,15.

    Раздел. 2 Честота на генотиповете и алелите на полиморфизма A163G в гена OPG

    Брой индивиди Честота на генотипите χ 2 Честота на алелите
    110 AG АА GG 3.5
    Р = 0,06578    		 A G
    A 82 23. 5 0,85 0,15
    С 74,55% 20,90% 4,55%
    т 79.5 28.05 2.5

    P - P стойност, A - абсолютно число, S - наблюдавани честоти в проценти, T - теоретично число съгласно закона на Харди-Вайнберг.

    Получените резултати са сравними с резултатите от изследвания на други автори, като напр с анализа на Zajíčková et al. (2008), които са анализирали 165 проби в своето проучване за наличие на полиморфизми A163G, T245G, G1181C.


    Графика 1. Сравнение на процентите на отделните генотипове [6]

    Нежен и др. (2002) в проучване върху полиморфизма на OPG във връзка с остеопоротични фрактури също разглежда полиморфизма A163G. Честотата на генотиповете е както следва: AA: 66,5%, AG: 27,9%, GG: 5,6%. В своето проучване те анализират и контролни проби. В сравнение с остеопоротичната група, те регистрират по-висока честота на генотип АА: 74,4% и по-ниска честота на AG хетерозиготи: 22,8% и GG хомозиготи: 2,8%.


    Графика 2. Сравнение на изследваните геотипове Bentle L. et al. и нашия анализ [5]

    5. Заключение

    Понастоящем остеопорозата е сериозен проблем за днешното население на света. Това е огромен здравен и социално-икономически проблем. Разходите, свързани с лечението на остеопороза, са високи. Малък процент от населението е информиран, че остеопорозата се счита за болест на цивилизацията, която води до бърз спад в качеството на живот и в много случаи е причина за смъртта. Поради тези причини е по-добре да предотвратите това заболяване, ако е възможно.

    Генът OPG е един от „кандидат-гените“ във връзка с генетични предразположения към остеопороза. Полиморфизмите в този ген корелират с различни костни фенотипове, включително фрактури. Тези резултати и заключения са само първата стъпка за предотвратяване на остеопороза. Остеопорозата може да бъде предотвратена чрез правилния начин на живот. Важен начин на живот тук играе важна роля, която е достатъчна консумация на млечни продукти и риба, прием на витамин D и достатъчно упражнения.

    Списък на използваната литература