елементи

абстрактно

Microglia представляват рационални, но предизвикателни цели за подобряване на целостта на бялото вещество поради техните дуалистични защитни и токсични задачи. Настоящото проучване изследва ефекта на омега-3 полиненаситените мастни киселини (n-3 PUFA) върху микроглиалните отговори на патологията на миелина в първичните култури и в модел на множествена склероза (MS), опустошително демиелинизиращо заболяване Докозахексаеновата киселина (DHA) и ейкозапентаеновата киселина (EPA), двете основни форми на n-3 PUFA в мозъка, инхибираха отделянето на азотен оксид и фактор на туморна некроза-α от първична микроглия при стимулация с IFN-γ и миелин. DHA и EPA също повишават миелиновата фагоцитоза in vitro. Следователно, n-3 PUFAs могат да инхибират възпалението, като същевременно стимулират полезни имунни отговори като микроглиална фагоцитоза. Проучванията in vivo показват, че добавката n-3 PUFA намалява демиелинизацията, предизвикана от дефекти, и подобрява двигателната и когнитивната функция. Положителните ефекти на n-3 PUFA са придружени от промяна в микроглиалната поляризация към полезен M2 фенотип in vitro и in vivo. Тези резултати предполагат, че n-3 PUFAs могат да бъдат клинично полезни като имуномодулиращи агенти за демиелинизиращи заболявания чрез нов механизъм, включващ превключване на микроглиалния фенотип.

В зависимост от околната среда микроглиите се различават по своя фенотип. Докато "класически активираният" M1 фенотип е свързан с повишено представяне на антиген и производството на токсични цитокини и реактивни кислородни видове, "алтернативно активираният" M2 фенотип се занимава с изчистването на клетъчните остатъци, локалното разрешаване на възпалението и освобождаването. трофични фактори, които насърчават регенерацията след неврологично увреждане 5, 6. Известно е, че поляризацията на фенотипа се влияе от прогресията на много неврологични заболявания, включително MS 7, инсулт 8, травматично увреждане на мозъка 9 и увреждане на гръбначния мозък 10, 11 и следователно може да представлява потенциална терапевтична цел за неврологични разстройства.

Омега-3 полиненаситените мастни киселини (n-3 PUFAs) са проучени за техните благоприятни ефекти при много животински модели на невродегенеративни заболявания, като болестта на Алцхаймер 12, 13, 14 и болестта на Паркинсон 15. Известно е, че няколко механизма са в основата на n-3 PUFA-медиираната невропротекция, като потискане на клетъчната смърт, инхибиране на възпалението и насърчаване на неврогенезата. Последните проучвания също са изследвали ефекта на n-3 PUFA върху патологията на бялото вещество. Например, добавянето на n-3 PUFA се свързва с по-малко лезии на бялото вещество и подобрена функция на изпълнение при възрастни възрастни 16, 17. В допълнение, няколко епидемиологични проучвания показват, че добавянето на n-3 PUFA е свързано с подобрени клинични резултати при пациенти с MS 18, 19. Полезните ефекти от добавянето на n-3 PUFA също са описани в експериментален животински модел на МС с експериментален автоимунен енцефаломиелит (EAE) и се приписват на модулиращия ефект на докозахексаеновата киселина (DHA) върху активирането на Т-клетъчно-зависимите от дендритни клетки 20. Въпреки това, ефектът на n-3 PUFA върху микроглията с отговор при МС или друга патология на бялото вещество не е изследван.

В настоящото проучване ние използвахме първични микроглиални култури и животински модел на демиелинизация, предизвикан от пренебрежимия ефект на n-3 PUFA върху микроглиалните отговори на патологията на миелина. Открихме, че DHA и ейкозапентаеновата киселина (EPA), основният n-3 PUFA в централната нервна система, инхибират по концентрационен начин микроглиалното освобождаване на възпалителни медиатори в отговор на миелинова и IFN-γ стимулация и повишават миелиновата фагоцитоза в ин витро. По-нататъшни изследвания на механизма показват, че DHA и EPA могат да изместят микроглиалната поляризация към фенотипа M2 при физиологични условия in vitro и да инхибират M1 поляризацията при възпалителни състояния. Проучванията in vivo допълнително потвърждават, че добавката с n-3 PUFA намалява демиелинизацията, предизвикана от пренебрежимо малък ефект и подобрява двигателните и когнитивните способности. Тези благоприятни ефекти на n-3 PUFA в животински модел също са придружени от преминаване към M2 микроглиалния фенотип in vivo .

резултатът

DHA и EPA инхибират възпалителните реакции при микроглията

За да се определи дали DHA и EPA могат да модулират микроглиалното активиране, първичната микроглия се третира с DHA или EPA в продължение на 24 часа, последвано от LPS стимулация (2,5 ng/ml) за още 24 часа. Освобождаването на азотен оксид (NO) и TNFα в хранителната среда се измерва като маркери на възпалителния отговор. Както е показано на Фигура 1, предварителната обработка на DHA значително намалява LPS-индуцираното освобождаване на NO и TNFα по зависим от концентрацията начин, започвайки от 20 μM (Фигура 1А и 1D). Ефектът на EPA е качествено подобен на този на DHA (Фигура 1В и 1Е). След това в повечето следващи експерименти бяха използвани най-ниските концентрации на DHA (20 μM) и EPA (20 μM), които успешно инхибираха освобождаването на NO и TNFα. Потискането на производството на NO и TNFα не може да се обясни с клетъчната токсичност, свързана с DHA и EPA, тъй като нито DHA, нито EPA увеличават извънклетъчното освобождаване на LDH в средата (Фигура 1C и 1F).

възползва

(A - F) Първични микроглии, инокулирани при 5 х 104/ямка, бяха предварително обработени с различни концентрации на DHA или EPA (5-80 μM) в продължение на 24 часа, последвано от LPS стимулация (2.5 ng/ml). Културната среда се събира 24 часа след LPS. Производството на азотен оксид (NO) (A, D) и фактор на туморна некроза-α (TNF-α) (B, E) се измерва като маркери на възпалението. Производството на лактат дехидрогеназа (LDH) (C, F) се измерва като анализ на клетъчната смърт. (G - J) Първични микроглии, инокулирани при 5 х 104/ямка, бяха предварително обработени с DHA (20 μM) или EPA (20 μM) в продължение на 24 часа, последвани от миелин (1, 5 или 10 μg/ml) със или без IFN- стимулация γ (5 ng/ml) за още 24 часа. Измерва се извънклетъчен NO (G, I) и TNF-a (H, J) в хранителна среда. Резултатите се изразяват като средна стойност ± SEM от три до четири независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 в сравнение с обработката на превозното средство.

Изображение в пълен размер

Освен това потвърдихме инхибиторния ефект на DHA и EPA върху възпалителни микроглиални отговори в свързан със заболяването in vitro модел, използвайки миелин и IFNγ като възпалителни стимулатори. Докато отделните активиращи фактори сами по себе си предизвикват само слаб микроглиален отговор, съвместното лечение с миелин и IFNy показва силни синергични и зависими от концентрацията ефекти върху възпалителните маркери в микроглията (Фигура 1G-J). В допълнение, предварителната обработка с DHA (20 μM) или EPA (20 μM) значително намалява производството на NO (индуцирано от миелин + IFNγ) (Фигура 1G и 1I) и TNFα (Фигура 1H и 1J). Тези данни категорично предполагат, че n-3 PUFAs инхибират микроглиалните реакции на свързаните с МС възпалителни стимули. Освен това EPA изглежда има малко по-големи противовъзпалителни ефекти.

DHA и EPA увеличават миелиновата фагоцитоза в микроглията

За да се изследва ефектът на n-3 PUFA върху миелиновата фагоцитоза, микроглиите се инкубират с различни концентрации на DHA или EPA, вариращи от 5 μM до 80 μM за 24 часа. Обозначен с Cyel миелин се добавя към културите за още 6 часа. След измиване миелиновата фагоцитоза се определя количествено чрез измерване на Cy3 флуоресценция в клетъчния лизат. Лечението с DHA (фигура 2А) или EPA (фигура 2В) при концентрации 10-40 μM значително повишава фагоцитозата на миелина. Конфокалното изображение потвърждава, че лечението с DHA (20 μM) - или EPA (20 μM) увеличава микроглиалната фагоцитоза (Фигури 2C).

Първичните микроглии бяха предварително обработени с различни концентрации на DHA или EPA (5-80 μM) в продължение на 24 часа, последвано от инкубация с Cy3-белязан миелин (0.5 μg/ml) за още 6 часа. (A, B) Миелиновата фагоцитоза се определя количествено като вътреклетъчна флуоресценция. (C) Представителни изображения, показващи, че лечението с DHA (20 μM) или EPA (20 μM) повишава фагоцитозата на миелина. Резултатите се изразяват като средна стойност ± SEM от три до четири независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 в сравнение с обработката на превозното средство.

Изображение в пълен размер

DHA и EPA модулират микроглиалната поляризация при физиологични и възпалителни състояния

Както е споменато във въведението, за микроглиите е известно, че заемат различни фенотипи, като M1 и M2, в отговор на различни външни стимули 10, 21. Следователно, ние използвахме високопроизводително PCR поле, за да анализираме експресията на множество M1 и M2 сигнализиращи гени в DHA или третирана с EPA микроглия. Както DHA, така и EPA показват забележителни тенденции за увеличаване на регулацията на M2 гените и намаляване на M1 гените при физиологични условия (Фигура 3A - 3B).

Първичните микроглии, инокулирани при 5 х 10 4/гнездо в 6-гнездова плака, бяха предварително обработени с DHA или EPA (по 20 цМ всяка) за 24 часа. (A-B) PCR в реално време показват, че лечението с DHA (A) и EPA (B) значително инхибира експресията на множество M1 гени и подобрява експресията на M2 гени. (C-F) PCR в реално време показва значително стимулиране на свързания с M2 ген CD206 (C) и TGFβ (D) след лечение с DHA или EPA. В допълнение, предварителната обработка с DHA или EPA значително инхибира експресията на M1-свързани TNF-α (E) и iNOS (F) гени след LPS стимулация (2.5 ng/ml) за 24 часа. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 спрямо контрола; P = 0,01, ## P = 0,001 спрямо LPS.

Изображение в пълен размер

Също така използвахме конвенционална PCR в реално време, за да проверим ефектите на DHA и EPA върху микроглиалната поляризация. Първичните микроглии се третират с DHA (20 μM) или EPA (20 μM) в продължение на 24 часа. В съответствие с PCR полевите данни, лечението с DHA и EPA значително повишава експресията на CD206 и/или TGFβ, два представителни M2 гена, при физиологични условия (Фигура 3C-3D). Лечението с DHA или EPA не инхибира експресията на TNFα и iNOS, два представителни гена M1, при физиологични условия, но значително намалява производството на тези два възпалителни гена след LPS стимулация за 24 часа (Фигура 3E и 3F). Тези данни предполагат, че DHA и EPA могат да модулират фенотипната поляризация на микроглията както при физиологични, така и при патологични условия.

Добавката n-3 PUFA намалява демиелинизацията в миши модел на MS

Мишките са хранени с диета, съдържаща 0,2% купризон с (N3H) със или без (N3L) n-3 PUFA обогатяване в продължение на 5 седмици. (A) Демиелинизиращите лезии в корпусното тяло (CC) бяха открити чрез Luxol бързо синьо (LFB) оцветяване (вляво), MBP оцветяване и електронна микроскопия (EM, вдясно). Патологичните промени в аксоните бяха разкрити чрез имуномаркиране със SMI32. Изображенията са представителни за секции от четири животни. (B) Интензитетът на MBP се измерва и изчислява като промяна на сгъването в сравнение със симулираната стойност. (C) Съотношението на SMI32 към MBP е изчислено като индикатор за увреждане на бялото вещество (аксонално увреждане и демиелинизация). (D) Western blot анализ на експресията на MBP. n = 4 мишки за всяка група. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 в сравнение със симулирани контроли.

Изображение в пълен размер

Добавката n-3 PUFA намалява неврологичните поведенчески дефицити в лекувания с купризон модел на демиелинизация

Мишките са хранени с диета, съдържаща 0,2% купризон с (N3H) със или без (N3L) n-3 PUFA обогатяване в продължение на 5 седмици. (А - С) Тестът за воден лабиринт на Морис е извършен 28-32 дни след началото на диетата с купризон. (А) Представителни изображения на плаващите пътища на мишки във всяка група, когато платформата е била налична (навигация на място; фаза на обучение) и след нейното отстраняване (тест на сондата; фаза на паметта). (Б) Латентността за потапяне на локализацията на платформата беше измерена при n-3 PUFA-допълнени и редовни диетични мишки 28 до 31 дни след началото на диетата с купризон. (В) Пространствената памет за местоположението на потапяната преди това платформа е измерена в n-3 PUFA-допълнени и редовни диетични мишки 32 дни след началото на диетата с купризон. Пространствената памет се изразява като времето, прекарано в целевия квадрант, когато платформата е била премахната. (D) Rotarod тест преди и след 2-5 седмици лечение с калризон. n = 8 животни/група. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 за дадените сравнения.

Изображение в пълен размер

Добавката n-3 PUFA насърчава поляризацията на M2 микроглията в животински модел на третирана с купризон демиелинизация

За да се изследват ефектите на n-3 PUFA върху микроглиалната поляризация в in vivo модел на демиелинизиращо заболяване, ние измерихме експресията на серия от M1 и M2 сигнализиращи гени чрез RT-PCR. Както се очаква, експресията на M1 гените (CD16 и iNOS) беше значително увеличена след 5 седмици от диетата с купризон. Добавянето на n-3 PUFA инхибира увеличаването на тези M1 гени (Фигура 6В) и увеличава експресията на трите M2 гена (CD206, YM1/2 и Arg1, Фигура 6А) при третирани с купризон мишки. По-нататък имунофлуоресцентното оцветяване показа, че експресията на маркерни протеини M1 (CD16) и M2 (CD206) се увеличава след 5 седмици от диетата с купризон (Фигура 6C-F). Добавката n-3 PUFA измести микроглиалната поляризация към М2 в този модел, както е показано чрез повишена експресия на CD206 и инхибиране на експресията на CD16 в корпусното тяло.

Мишките са хранени с диета, съдържаща 0,2% купризон с (N3H) със или без (N3L) n-3 PUFA обогатяване в продължение на 5 седмици. (A-B) PCR в реално време за маркери M1 (A) и маркери M2 (B) беше извършена, като се използва обща РНК, извлечена от мозолистото тяло. (C) Представително имунофлуоресцентно оцветяване на Iba1 с CD16/32 (M1) или CD206 (M2) в мозолистото тяло. Скала: 40 μm. (D - F) Количествено определяне на клетки Iba1 + (D), CD16/32 + (E) и CD206 + (F) в мозолистото тяло. n = 4 животни на група. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 спрямо симулация; #P ≤ 0, 05, ## P ≤ 0, 01, ### P ≤ 0, 001 срещу CPZ + N3L.

Изображение в пълен размер

дискусия

Резултатите, представени в този документ, демонстрират силния благоприятен ефект на DHA и EPA върху микроглиалните отговори на патологията на миелина. Способността на n-3 PUFA да инхибира възпалението, като същевременно увеличава фагоцитозата в стимулираната от миелин микроглия, показва нови вълнуващи възможности за лечение на неврологични заболявания. В допълнение, откриването на преместване от M1 към M2 показва благоприятна модулация на фенотипа n-3 PUFA микроглия.

Противовъзпалителните ефекти на DHA и EPA са докладвани при различни невродегенеративни заболявания, включително инсулт и болест на Алцхаймер 24, 25, 26, 27, 28, 29. Показано е също така, че N-3 PUFAs повишават микроглиалната фагоцитоза на амилоид-β в in vitro модел AD 30. Ролите на DHA и EPA обаче в поляризацията на микроглията и в патологията на МС не са изследвани преди това; това изследване е първото, което изследва ролята на n-3 PUFAs в микроглиалната поляризация в модел, свързан с демиелинизиращо заболяване. Установихме, че n-3 PUFAs имат благоприятен ефект върху микроглиалната функция чрез диференциално инхибиране на миелин и IFN-γ-индуцирано възпаление и повишена миелинова фагоцитоза. Тези функционални ефекти са свързани с микроглиална поляризация към доминиращия M2 фенотип. Фенотипната поляризация може да насърчи микросреда, която се противопоставя на възпалителни увреждания и по-нататъшна демиелинизация при МС, което води до подобрена неврологична функция in vivo .

Някои проучвания предполагат, че ендогенно преминаване от микроглиалния фенотип на М1 към М2 се случва в началото на ремиелинизацията в моделите MS 6. В допълнение, селективното изчерпване на M1 или M2 фенотипни клетки показа, че той насърчава M2 фенотипа, докато M1 фенотипът нарушава регенерацията на олигодендроцитите в този модел 6. Следователно е възможно, че предоставената с n-3 PUFA поляризация на М2 може не само да намали демиелинизацията, както е показано в това проучване, но и да се възползва от процеса на ремиелинизация в МС. Следователно текущите проучвания в нашата лаборатория изследват ефекта на n-3 PUFA върху диференциацията на олигодендроцитите и ремиелинизацията.

В допълнение към благоприятните ефекти върху микроглиалната поляризация, нашето неотдавнашно проучване показа и директен защитен ефект на DHA срещу екситотоксичност в олигодендроцитите 31. По този начин, както директните (чрез олигодендроцити), така и индиректните (чрез микроглия) механизми могат да допринесат за защитата на n-3 PUFA-бяло вещество. Интересното е, че оптималната доза DHA за противовъзпалителния ефект при микроглията и защитния ефект при олигодендроцитите е приблизително 20 μM 31. DHA или EPA в подобен дозов диапазон също потиска възпалението в човешките Т-хелперни клетки и увеличава секрецията на противовъзпалителни фактори от моноцити 32. В допълнение, проучване върху животни потвърждава, че добавките с DHA могат значително да повишат нивата на DHA в мозъка до приблизително 10-20 μM/g влажна мозъчна тъкан за няколко седмици 33. Поради способността им да се насочват към множество клетъчни типове и лекотата на хранителни добавки, n-3 PUFAs трябва да бъдат допълнително изследвани като терапевтично средство за пациенти с МС. Ако DHA и EPA са в състояние да предизвикат подобни защитни ефекти при хората, тези естествени съединения ще служат като безопасно и евтино лечение за 2,3 милиона души по света, страдащи от МС, както и за безброй други пациенти с демиелинизиращи заболявания.

методи

Култури, обогатени с първична микроглия

Първични култури, обогатени с микроглия, бяха приготвени от цели мозъци на еднодневни малки, както е описано по-горе 34. Накратко, мозъчните тъкани се стриват след отстраняване на мозъчните обвивки и кръвоносните съдове. След това клетките бяха засяти в 5 x 10 7 клетъчна/150 cm 3 колба за култивиране в среда DMEM/F12, съдържаща 10% топлинно инактивиран фетален говежди серум, 2 mM L-глутамин, 1 mM натриев пируват, 100 μM несъществени аминокиселини киселини. U/ml пеницилин и 50 μg/ml стрептомицин. След достигане на сливан монослой от глиални клетки (обикновено в рамките на 12 до 14 дни след първоначалното инокулиране), микроглиите се събират, събират и резецират. След това културите на Microglia (97% чистота) се третират с DHA или EPA (Sigma, St. Louis, MO), разтворени в среда за 24 часа, последвани от различни концентрации на миелин и IFN-y за допълнителни 24 часа.

Приготвяне на миелин

Миелинът се изолира от мозъка на 3-месечни мишки чрез центрофугиране с градиент на плътността на захарозата (0,32 М и 0,85 М) при 75 000 х g, както е описано по-горе 35. Съдържанието на миелинов протеин се определя чрез анализ на протеина в Брадфорд (Bio-Rad) с говежди серумен албумин като стандарт. Концентрацията на ендотоксини в миелиновите остатъци е