ix-1

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Експресията на IEX-1 се увеличава в бялата мастна тъкан след HFD хранене
  • Недостигът на IEX-1 прави мишките устойчиви на индуцирано от HFD затлъстяване
  • Недостигът на IEX-1 подобрява метаболизма на глюкозата
  • Недостигът на IEX-1 инхибира индуцираното от HFD възпаление на мазнините и черния дроб
  • Липсата на IEX-1 увеличава енергийните разходи поради повишената термогенеза
  • Недостигът на IEX-1 предотвратява индуцирана от HFD промяна във фенотипа на макрофагите в мастната тъкан
  • дискусия
  • методи
  • Животни и грижи за животните
  • Измервания на цяла кръв и плазма
  • Тестове за глюкоза и инсулинов толеранс
  • хистология
  • имунохистохимия
  • имуноблотинг
  • Изолация и SVF имунофенотипиране
  • Екстракция на РНК и количествен PCR анализ в реално време
  • Разходи за цяла животинска енергия и производство на топлина
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Коментари

елементи

абстрактно

Затлъстяването е един от най-опасните проблеми на общественото здраве днес поради високото му разпространение (59 милиона американци) и връзката му с различни хронични заболявания като диабет тип 2, атеросклероза, хипертония, безалкохолен мастен черен дроб, имунно-медиирани нарушения и някои видове рак. Той е свързан с хронични ниски нива на активно възпаление във важни метаболитни тъкани, включително мастна тъкан и черен дроб. Хроничното възпаление променя метаболизма на глюкозата и липидите и води до прекомерно съхранение на енергия и инсулинова резистентност 2, 3, 4, 5, 6. Последните проучвания са предоставили сериозни доказателства, че вроденият имунен отговор и последващото възпаление се появяват в много по-ранен етап от началото на затлъстяването и допринасят критично за неговата патогенеза 2, 4, 5, 6. По-специално, NF-кВ, централен възпалителен медиатор, играе основна роля при индуцираното от диетата възпаление. Блокадата на NF-кВ и последващите му медиатори предпазва мишките не само от инсулинова резистентност, предизвикана от инсулинова резистентност, но и от затлъстяване 5, 7, 8, което предполага фундаментална връзка между възпалението и енергийните разходи. Въпреки сериозните доказателства за участието на възпалението в метаболитните дисбаланси, основните медиатори, които нарушават енергийния баланс с висок прием на мазнини, не са напълно дефинирани.

резултатът

Експресията на IEX-1 се увеличава в бялата мастна тъкан след HFD хранене

Недостигът на IEX-1 подобрява метаболизма на глюкозата

Липсата на IEX-1 увеличава енергийните разходи поради повишената термогенеза

дискусия

Затлъстяването е хронично разстройство, което възниква поради дисбаланс в енергийния метаболизъм 2, 3, 5, 6, 8. Първичните физиологични регулатори на разхода на енергия, особено с висок калориен прием, не са напълно изяснени. Тук представяме неизвестна досега роля на IEX-1 в енергийния метаболизъм. Нулевата IEX-1 мутация предпазва мишките от развитието на HFD-индуцирано затлъстяване и инсулинова резистентност. IEX-1 -/- мишките показаха увеличен разход на енергия поради повишена термогенеза. Специфичните за тъканите проучвания показват, че дефицитът на IEX-1 увеличава експресията на термогенните гени и причинява покафеняване на eWAT и scWAT, в съответствие с наблюдението на повишена експресия на IEX-1 изключително в тези тъкани при хранене с HFD. Това обяснява повишената термогенеза и енергийните разходи при KO мишки, което осигурява механичен поглед върху постния фенотип на тези мишки. Изследването идентифицира IEX-1 като важен модулатор на енергийния метаболизъм по време на висококалориен прием и предлага нова цел за лечение на затлъстяване и други метаболитни нарушения.

Предстои да се изясни как дефицитът на IEX-1 поддържа мастни ААМ. IEX-1 е силно експресиран в макрофаги 11, 12, 14. Той играе решаваща роля в регулирането на апоптозата в имунните клетки и контролира тяхната хетерогенност 9, 12, 16, 33, 34, 35, 36. Например по-рано съобщавахме, че IEX-1 реципрочно регулира преживяемостта и апоптозата на Т-клетките в зависимост от подмножество 16, 36. Дефицитът на IEX-1 увеличава апоптозата на Th1, като същевременно насърчава оцеляването на Th17 клетките, което води до засилен отговор на IL-17 при миши модели на колит и артрит. Може би индуцираната от HFD активност на IEX-1 в макрофаги за предпочитане увеличава преживяемостта на CAM подмножество, но не и AAM в затлъстелите мазнини чрез предполагаемото му антиапоптотично действие. Следователно, дефицитът на IEX-1 предотвратява индуцираното от HFD увеличение на популацията на CAMs. Независимо от това, нашите данни показват, че IEX-1 е необходим за HFD-индуциран превключвател във фенотип на ATM, като по този начин регулира AAMs-медиираното изземване.

Адипозните макрофаги играят решаваща роля при свързаното със затлъстяването възпаление, като превключват техния фенотип от противовъзпалително състояние (AAM) към провъзпалително състояние (CAM) при затлъстели мазнини 7, 18, 37, 38. Дефицитът на IEX-1 инхибира прехода на такива ATMs и по този начин AAMs са преобладаващи ATM в WAT на мишки IEX-1 -/- дори след 20 седмици HFD, осигурявайки механизъм, чрез който IEX-1 дефицитът инхибира индуцираното от HFD възпаление. Предполага се, че увеличената популация на AAM и отслабеното възпаление при мишки IEX-1 -/- може да са допринесли за подобрената чувствителност към инсулин, наблюдавана при тези мишки 32, 39. IEX-1 може да представлява нов медиатор на свързано със затлъстяването възпаление, вероятно поради ролята му в регулирането на фенотипа на ATM. По този начин предлагаме IEX-1 да упражнява двойно действие при затлъстяване чрез банкомати; (i) насърчава индуцираното от CAM възпаление и (ii) инхибира биогенезата на бежовите мазнини.

В заключение, настоящото проучване идентифицира по-рано неоценена роля на IEX-1 в енергийното регулиране. Дефицит на IEX-1 предизвиква покафеняване и активира термогенни гени в WAT чрез насърчаване на алтернативно активиране на мастни макрофаги по време на HFD хранене. Следователно, IEX-1 -/- мишките бяха защитени от HFD-индуцирано увеличаване на теглото поради подобрена термогенеза и увеличен разход на енергия. Алтернативното активиране на макрофаги също отслабва индуцираното от HFD възпаление и подобрява инсулиновата резистентност. Дали поддържането на AAM е основният механизъм, чрез който дефицитът на IEX-1 инхибира развитието на затлъстяване, все още предстои да се определи.

методи

Животни и грижи за животните

Всички проучвания с мишки са проведени в съответствие с Ръководството на NIH за грижа и употреба на лабораторни животни. Всички проучвания бяха прегледани и одобрени от и в съответствие с Подкомитета на MGH за изследване на грижите за животните. IEX-1 -/- мишки са генерирани в нашата лаборатория, както е описано по-рано 17. В това проучване са използвани мъжки мишки на фона 129Sv/C57BL/6. IEX-1 -/- мишките и техния WT дете, хранени с диета, хранени с високо съдържание на мазнини (45% калории от мазнини; D12451 Research Diets Inc) или нормален чау (13,2% калории от мазнини), започвайки на 8 седмична възраст в продължение на 20 седмици. Животните са настанени в специфично съоръжение без патогени с 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл в животинските съоръжения на MGH и им се дават храна и вода ad libitum. Записите на ректалната температура бяха определени с прецизен термометър FHC (FHC Bowdoin ME) около обяд. Телесното тегло се проследява на всеки 2 седмици по време на проучването.

Измервания на цяла кръв и плазма

Пълна кръв се събира в хепаринизирани епруветки и плазмата се отделя чрез центрофугиране. Плазмените концентрации на инсулин се измерват с инсулинов ELISA комплект (Crystal Chem Inc, Downers Grove IL). Кръвната глюкоза се измерва с помощта на глюкометър Ultra Touch Accuchek. Общият холестерол в плазмата, триглицеридите и NEFA се измерват с колориметричен анализ (Wako, Cambridge MA). TNF-α и IL-10 в плазмата са измерени чрез ELISA комплекти (eBioscience).

Тестове за толерантност към глюкоза и инсулин

За IGTT, мишките се инжектират интраперитонеално с 1,5 mg глюкоза/g телесно тегло след 12 часа на гладно 5. Кръвната глюкоза се измерва на базална, 15, 30, 45, 60 и 120 минути от опашната кръв с помощта на глюкомер. За ITT мишките получиха интраперитонеална инжекция от 0,75 единици човешки инсулин (Novolin, Novo Nordisk) на kg телесно тегло след 3 часа гладуване 5. Концентрациите на кръвната глюкоза се определят, както е описано по-горе.

хистология

След дисекция пробите се фиксират чрез потапяне в 10% буфериран формалин за 48–72 часа, дехидратират се, изчистват се и след това се влагат в парафин. Бяха получени серийни срезове (с дебелина 5 μm), които бяха депарафинизирани, рехидратирани и след това оцветени с хематоксилин и еозин. След това изображенията на секциите бяха сканирани с помощта на NanoZoomer и анализирани с помощта на NDP изглед софтуер (Hamamatsu, Bridgewater, NJ). Средната площ на адипоцитите от 100 произволно сортирани адипоцити на образец от секции eWAT беше определена с помощта на NDP софтуер за изглед.

имунохистохимия

Формалин-фиксираните парафинови вградени тъканни участъци бяха депарафинизирани и рехидратирани преди демаскиране на антигена чрез кипене в 10 mM натриев цитрат и проникване с 0,1% TBS-Triton в продължение на 15 минути. Ендогенната пероксидазна активност се потушава с инкубация с 3% водороден пероксид в продължение на 15 минути. Секциите бяха блокирани в нормален кози серум и инкубирани с първично заешко анти-IEX-1 (ab65152 Abcam, Cambridge MA) или анти-UCP1 (ab10983 Abcam) антитяло за една нощ при 4 ° C. След това секциите бяха оцветени с биотинилирано вторично антирабит антитяло за 1 час при стайна температура и цветът се визуализира с 3,3'-диаминобензидин (DAB), като се използва Vecta-байц ABC комплект (Vector Laboratories). Секции за откриване на UCP1 се оцветяват с полимер AP анти-заешко вторично антитяло за 30 минути при стайна температура (Biocare Medical, Brookline MA) и цветът се визуализира чрез добавяне на бърз червен хромоген (Biocare Medical). Разрезите бяха оцветени с хематоксилин преди дехидратация и поставяне на покривни стъкла с монтажна среда. Слайдовете бяха сканирани с помощта на NanoZoomer и анализирани с помощта на софтуер за изглед NDP (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).

имуноблотинг

Тъканите се събират в RIPA фосфатен буфер, допълнен с протеаза и фосфатазни инхибитори (Sigma-Aldrich). Екстрактите се фракционират с помощта на 4–20% Miniprotein TGX гел (BioRad, Waltham MA), прехвърлят се в нитроцелулозни мембрани и се инкубират с първични антитела срещу миши IEX-1 (1: 200; sc33171 Santa Cruz Biotech, Dallas TX), UCP1 (1: 5000 eWAT и scWAT и 1:20 000 за BAT, ab10983 Abcam) или α-тубулин (abcam) за една нощ при 4 o C. След измиване мембраните се инкубират с HRP-свързан анти-заешки IgG (Cell Signaling Technology) . Мембраните бяха инкубирани с ECLPlus (GE Healthcare, Уилмингтън, Масачузетс) и хемифлуоресценция беше открита с Versadoc 4000MP изображение. Заловените изображения са анализирани със софтуера ImageJ (NIH).

Изолация и SVF имунофенотипиране

4-5 мишки от мъжки пол за генотип бяха евтаназирани под дълбока анестезия със смес от кетамин (120 mg/kg) + ксилазин (12 mg/kg), прилагани интраперитонеално. Epididymal WAT се събират и смилат с ножици и се усвояват с 1 mg/ml колагеназа II в PBS, съдържащ CaCl2 (1,4 mM) и BSA (0,5%) за 30 минути при 37 ° С в шейкър. Храносмилането беше спряно чрез добавяне на равно количество DMEM, съдържащо 10% FBS. Клетъчната суспензия се филтрира през 100 μm филтър и след това се върти при 300 g за 5 минути, за да се отделят плаващи адипоцити от пелета от стромална съдова фракция (SVF). SVF пелетата се ресуспендира в 0,5 ml RBC лизисен буфер за 5 минути върху лед, центрофугира се за 5 минути при 300 g и се ресуспендира във FACS буфер (PBS с 2% BSA) при концентрация 6 х 106 клетки/ml. Клетките се инкубират на тъмно върху лед в продължение на 20 минути във Fc блок (BD Pharmingen, Сан Хосе, Калифорния). Без измиване клетките бяха инкубирани с флуоресцентно белязани антитела: F4/80-фикоеритрин, CD11c-фикоеритрин-Cy7 и CD206-Alexaflour 647 за допълнителни 30 минути, както е указано от производителя (BD Bioscience). Клетките бяха анализирани с помощта на FACS Aria клетъчен сортиращ (BD Biosciences). Неоцветените и единични петна бяха използвани за настройка на компенсации и порти.

Екстракция на РНК и количествен PCR анализ в реално време

Тъканите или адипоцитите и SVF фракциите на eWAT са получени от мишки под дълбока анестезия, както е описано по-горе, и съхранявани при -80 o C до екстракция. Общата РНК се извлича с използване на Trizol (Invitrogen, Carlsbad CA). cDNA беше синтезирана с помощта на комплект за синтез на първа верига Superscript III (Invitrogen). Експресионните нива на mRNA бяха измерени чрез количествен PCR анализ в реално време (qRT-PCR) в Mastercycler realplex 2 (Eppendorf), използвайки Kapa sybr бърз или сонда бърз qPCR микс (Kapa Biosystems), използвайки конвенционален Sybr или taqman (За IEX-1) грундове. Промените в относителната генна експресия бяха нормализирани до нивата на 18S иРНК и бяха определени с помощта на относителния Ct метод.

Разходи за цяла животинска енергия и производство на топлина

IEX-1 -/- мишки и WT отпадъци (n = 4–5 на генотип), хранени с HFD или ND в продължение на 7–8 седмици, бяха поставени в стандартни метаболитни клетки. Консумацията на кислород (VO 2), производството на въглероден диоксид (VCO 2), производството на топлина, спонтанната двигателна активност и приема на храна са измерени с помощта на Комплексната лабораторна система за мониторинг (TSE system Inc), интегриран калориметър с отворен кръг, оборудван с оптичен лъч система за наблюдение на дейността. Тези параметри бяха наблюдавани в продължение на 3 последователни дни (3 тъмни цикъла и 3 светлинни цикъла) и в анализите бяха използвани средните стойности за 3 дни. Съотношението на дихателния обмен (RER) се изчислява като отношение на VCO2 към VO2. Съставът на тялото е измерен с помощта на Echo MRI анализатор (Medical Device Company, Хюстън, Тексас).

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средна стойност ± стандартни грешки на средната стойност (SEM). Разликите между две групи или две лечения, включително нива на IEX-1 иРНК и протеин в ND и HFD, хранени с WT мишки, и експресия на иРНК на цитокини в ATMs бяха сравнени с двустранен t тест на Student. Използвани са двупосочни повторни измервания ANOVA за сравняване на телесното тегло, кръвните параметри, кръвната глюкоза по време на IGTT и ITT, нивата на експресия на иРНК в eWAT, scWAT, BAT и черния дроб, VO 2 и производството на топлина и процентите на CAM и AAM в SVF сред различни групи. P стойности