активността

  • абстрактно
  • целта:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • Материали и методи
  • Животни и експериментален дизайн
  • Събиране и обработка на тъкани
  • Биохимичен анализ
  • Хистологично и имунохистохимично оцветяване
  • На място TdT-медиирани dUTP анализи за N-терминално маркиране
  • Уестърн петна
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • Блокадата на активността на TLR2 намалява и стабилизира атеросклеротичните лезии в брахиоцефалната артерия
  • TLR2 блокадата облекчава възпалението в атеросклеротичните артерии
  • TLR2 блокадата намалява апоптозата на макрофагите и експресията на CHOP при напреднали атеросклеротични лезии
  • TLR2 медиира ускореното атеросклеротично производство и регулира експресията на CHOP и апоптозата при ApoE-дефицитни мишки, получаващи HC диета.
  • дискусия
  • Принос на автора

абстрактно

Сигнализирането за подобен на рецептор 2 (TLR2) играе решаваща роля в инициирането на атеросклероза. Целта на това проучване беше да се изследва дали блокирането на активността на TLR2 може да има терапевтични ефекти върху напреднала атеросклероза.

методи:

Четиридесет седмици дефицит на аполипопротеин Е (ApoE -/-), които се хранят с нормална диета, се инжектират интравенозно с неутрализиращо TLR2 антитяло или IgG, съответстващ на изотип IgG, в продължение на 18 седмици. Двойните нокаутиращи ApoE -/- Tlr2 -/- мишки се считат за положителни контроли. В края на лечението се измерват плазмените нива на липидите и се анализират морфологията на плаките, експресията на възпалителния цитокин и артериалната апоптоза. Във втората част на това проучване, шестседмични мишки ApoE -/- и ApoE -/- Tlr2 -/-, хранени с диета с висок холестерол в продължение на 12 до 24 седмици, бяха изследвани за нивата на експресия на TLR2 и апоптотични маркери в артерии.

резултатите:

Блокирането на активността на TLR2 от неутрализиращо TLR2 антитяло или нокаут на гена Tlr2 не променя нивата на плазмените липиди при ApoE -/- мишки. Фармакологичните и генетични манипулации обаче значително намаляват размера на плаката и съдовата стеноза и повишават стабилността на плаките в брахиоцефалните артерии. Защитните ефекти на TLR2 антагонизма са свързани с потисната експресия на провъзпалителните цитокини IL-6 и TNF-α и инактивиране на транскрипционните фактори NF-kB и Stat3. В допълнение, блокирането на активността на TLR2 намалява индуцираната от стрес апоптоза на макрофагите в брахиоцефалните артерии, което може да насърчи диференциацията на некротичните ядра при напреднала атеросклероза. В допълнение, диетата с високо съдържание на холестерол значително ускори атеросклеротичното производство и увеличи проапоптотичния протеин PDO и експресията на апоптоза при мишки ApoE -/-, отколкото при мишки ApoE -/- Tlr2 -/-.

заключение:

Фармакологичната или генетична блокада на активността на TLR2 намалява и стабилизира напреднали атеросклеротични лезии при ApoE -/- мишки. По този начин насочването към сигнализиране на TLR2 може да бъде обещаваща терапевтична стратегия срещу напреднала атеросклероза.

Атеросклерозата е често срещана причина за сърдечно-съдови заболявания. Сърдечно-съдовите заболявания са водещата причина за смърт и нарастваща заплаха за човешкото здраве в световен мащаб 1. Епидемиологичните и експериментални проучвания потвърждават преобладаващата роля при възпалението във всички стадии на атеросклероза, от образуването на ранни стабилни атеросклеротични плаки до напреднали плаки, които са склонни към разкъсване 2, 3, 4, 5. Няколко проучвания наскоро се фокусираха върху ефектите на фармакологичните интервенции върху стабилността на напреднали плаки, тъй като нарушаването на нестабилните лезии допринася за острия коронарен синдром 4, 6, 7. Нестабилните плаки се характеризират с големи некротични ядра, пълни с липиди, капсулирани в тънка влакнеста капачка, високи нива на противовъзпалителни медиатори и матрични протеази и апоптоза. Развитието на нестабилни плаки е свързано с участието както на вродената, така и на адаптивната имунна система.

Toll-подобни рецептори (TLR) са семейство от разпознаващи образци рецептори, които играят ключова роля за вродения имунитет и инициират възпалителни реакции. Лигирането на тези рецептори инициира активирането на ядрен фактор KB (NF-kB), което води до експресията на широк спектър от възпалителни гени 8, 9. Сред характеризираните TLR, TLR2 е уникален по своята способност да хетеродимеризира с TLR1 или TLR6, което води до относително широка лигандна специфичност, включително ендогенни и екзогенни лиганди 10, 11. По-специално, всички потенциални ендогенни агонисти на TLR2, включително бигликан, силно подвижната хромозомна протеинова кутия 1 (HMGB1) и окислени липопротеинови компоненти, се намират в атеросклеротични лезии 12, 13, 14. В допълнение, сигналната пътека TLR2 е свързана с реакция на ендоплазмен ретикулум (ER) на стрес. ER стресът може да увеличи експресията на TLR2 in vitro и in vivo, а TLR2 допринася за апоптозата в макрофаги, които са подложени на липидно индуциран ER стрес 15. По този начин TLR2 може да бъде потенциална цел за терапевтични интервенции при лечението на атеросклероза.

В действителност, TLR2 лиганди и свръхекспресия на TLR2 са наблюдавани в човешките атеросклеротични плаки, а важната роля на TLR2 в матриксното възпаление и разграждане се посочва от клетки, открити в атеросклеротични лезии на човешката каротидна 16, 17. В допълнение, дефицитът на TLR2 ген в миши модел значително инхибира прогресията на ранната атеросклероза 18, 19. Има обаче ограничени данни за ефектите на TLR2 върху напреднали лезии при животински модели. Използвайки фармакологично и генетично инхибиране на активността на TLR2, ние изследвахме терапевтичните и профилактични ефекти на TLR2 блокадата върху напреднали атеросклеротични плаки в брахиоцефалната артерия на мишки с дефицит на аполипопротеин Е (ApoE), които все още не са оценени. Установихме, че блокирането на активността на TLR2 намалява и стабилизира напреднали атеросклеротични лезии при мишки с дефицит на ApoE чрез отслабване на възпалението и ER стреса в кръвоносните съдове. Нашата работа предполага, че активността на TLR2 играе решаваща роля в патогенезата на напреднала атеросклероза и че блокирането на този сигнален път може да бъде обещаваща стратегия при лечението на атеросклероза и нейните усложнения.

Материали и методи

Животни и експериментален дизайн

ApoE -/- Tlr2 -/- мишки са генерирани от хетерозиготни кръстоски на ApoE -/- мишки (фон C57BL/6, лаборатория Jackson) и мишки Tlr2 -/- (фон C57BL/6, лаборатория Jackson). Генотиповете на хомозиготни двойни нокаут или еднократни ApoE мишки бяха потвърдени чрез PCR, както е описано по-горе 18. Всички животни бяха настанени при стандартни условия за влажност, стайна температура и цикли на тъмна светлина, с достъп до вода и храна ad libitum. Изследванията са проведени в съответствие с принципите, установени от Институционалния комитет по етика на грижите и лечението на животните в биомедицинските изследвания (Пекин, Китай).

В първия експеримент всички мишки бяха хранени с нормална диета [4% (w/w) мазнини, 20% (w/w) протеин, GB-14924]. На 40-седмична възраст мишките ApoE -/- Tlr2 +/+ бяха разделени на случаен принцип в 3 групи (n = 16 на група) и третирани с физиологичен разтвор, съответстващ на изотип IgG антитела (SouthernBiotech, Бирмингам, AR, САЩ) или TLR2 неутрализиращо антитяло (R&D System, Minneapolis, MN, USA) интравенозно. Дозировката и времето на приложение на антитела (ab) са определени въз основа на предишните ни проучвания 20, 21. Първият режим на дозиране беше 200 μg/kg на всеки 4 дни в продължение на 2 седмици, а останалите дози бяха 100 μg/kg веднъж седмично в продължение на още 16 седмици. ApoE -/- Tlr2 -/- мишки, наречени двойно нокаутираща (DK) група, бяха настанени при същите условия. Всички мишки бяха умъртвени на 58-седмична възраст. Във втория експеримент мишките ApoE -/- Tlr2 +/+ и ApoE -/- Tlr2 -/- са хранени с атерогенна диета с високо съдържание на холестерол (HC) [15,8% (w/w) мазнини, 1,25% (w/w ) wt) холестерол] от 6-седмична възраст и са жертвани за анализ на 12, 18 и 24-седмична възраст (n = 8 на група).

Събиране и обработка на тъкани

След като мишките гладуват в продължение на 4 часа, се получава кръв за измерване на липиди, като се използва ретро-орбитален венозен плексус. След това мишките се анестезират с 50 mg/kg ip пентобарбитал и се перфузират през лявата камера с леден студен фосфатен буферен разтвор при физиологично налягане. Аортите бяха бързо изрязани, замразени бързо от аортната дъга за бифуркация на илеята и поддържани при -80 ° C преди анализ на протеина. Цялата брахиоцефална артерия от всяко животно беше фиксирана в 4% параформалдехид за 24 часа при 4 ° C, вграден в парафин и серийно нарязан (5 μm дебел).

Биохимичен анализ

Плазмените нива на общия холестерол, холестерола на липопротеините с висока плътност (HDL-C), холестерола на липопротеините с ниска плътност (LDL-C) и триглицеридите се определят с помощта на търговски комплекти (Biosino, Пекин, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя.,

Хистологично и имунохистохимично оцветяване

Всяка пета част от серийните секции беше оцветена с модифицирано оцветяване с пентахром Movata или червено Sirius, за да се оцени състава и стабилността на напреднали атеросклеротични плаки в брахиоцефалната артерия и бяха анализирани 12 до 15 секции на мишка за всеки цвят. Оцветените секции бяха заснети при увеличение от 200 пъти и 2-3 секции на секция, съдържаща цялата лезия, бяха заснети и анализирани с помощта на Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Средната стойност на всички секции представлява атеросклеротична лезия на една мишка.

За имунохистохимично оцветяване най-малко 4 участъка от брахиоцефалната артерия на мишка се инкубират с анти-миши макрофагични антитела на плъхове (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), с миши анти-мускулни моноклонални антитела. актин (α-SMA, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, САЩ) или заешко антиматрично металопротеиназно (MMP) -2 антитяло (1: 100, Abcam, Cambridge, UK). Свързаните антитела се комплексират с асоциирани с пероксидаза вторични антитела и се откриват с диаминобензидин. Оцветените секции бяха заснети при увеличение 200x и 2 до 3 зрителни полета, съдържащи цялата лезия на секция, бяха заснети и анализирани с помощта на Image-Pro Plus 5.0. Средната стойност на всички участъци представлява експресията на целевите протеини в атеросклеротичната лезия.

За оценка на колокализацията на макрофаги и хомоложен C/EBP протеин (CHOP), анти-миши макрофагични антитела на плъхове (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) и миши анти-CHOP моноклонални антитела ( 1: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) са използвани като първични антитела. Четири среза на миши тъкани бяха инкубирани с маркирани с Alexa 647 пилешки анти-плъхове и Alexa 488-белязани заешки вторични антитела (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Разрезите бяха разгледани с помощта на конфокален микроскоп E2000U и оценени с помощта на софтуера Leica TCS SP2.

In situ TdT-медиирани dUTP анализи за N-терминално маркиране

Апоптотични клетки в атеросклеротични лезии бяха открити чрез TdT-медиирано dUTP nick-end маркиране (TUNEL) с помощта на комплекти (Promega, Madison, WI, USA). Ядрата бяха оцветени с DAPI. TUNEL-положителните ядра са преброени под обърнат флуоресцентен микроскоп на Olympus I720. За да се оцени колокализацията на макрофагите, макрофагите бяха открити, използвайки анти-миши макрофаги антитяло на плъх (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), последвано от пилешко вторично антитяло, обозначено с Alexa 647. (1: 200, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ).

Уестърн петна

След тъканна хомогенизация, извлечените протеини се разделят с 12% SDS-PAGE и се имуноблотират със специфични антитела, включително анти-MMP-2 (Abcam, Кеймбридж, Великобритания), анти-фосфо-NF-кВ р65, анти-NF. -KB p65, разцепена каспаза-3, анти-CHOP (клетъчна сигнална технология, Danvers, MA, САЩ), анти-фосфо-Stat3, анти-Stat3, анти-интерлевкин (IL) -6, анти-IL-10 или фактор антитуморна некроза (TNF) -α (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Вторичните сигнали за антитела бяха открити с помощта на ECL Plus Western blot реактиви (Amersham Biosciences, PA, USA) съгласно инструкциите на производителя.

Статистически анализ

Данните са представени като средно ± SEM. Сравненията между няколко групи бяха извършени с еднопосочен ANOVA с помощта на SPSS. Данните, които не показват нормално разпределение, бяха анализирани с помощта на теста Mann-Whitney U. P

Блокирането на активността на TLR2 не влияе на плазмените нива на липидите. Общи нива на холестерол (A), триглицериди (B), LDL-C (C) и HDL-C (D) бяха определени при мишки ApoE -/- на 58 седмици, третирани с физиологичен разтвор, IgG или TLR2ab iv в продължение на 18 седмици и при ApoE с/с дефицит на TLR2// - мишки (DK) са били хранени с храна за животни. Данните са представени като средно ± SEM (n = 12 мишки/група).

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

TLR2 блокадата намалява и стабилизира напредналите атеросклеротични плаки в брахиоцефалната артерия. (A и B) Оцветяването с Movat показва състава на напреднали лезии от групи с физиологичен разтвор, IgG и TLR2ab и TLR2. Стрелките показват ерозия на носителя. Скалите представляват 200 μm в панел A и 50 μm в панел B. Прилагане на TLR2ab в продължение на 18 седмици и дефицит на TLR2 значително намалява средната площ на лезията (C), максималната стеноза на лезията (D), максималните некротични ядра/плака (E), и минимална средна дебелина (F) при мишки с дефицит на ApoE. L, лумен; М, медия. Данните са представени като средно ± SEM (n = 10 мишки/група). b P

TLR2 блокадата стабилизира напредналите атеросклеротични плаки. В групите за оцветяване с дефицит на TLR2ab и TLR2, червеното оцветяване на Sirius показва повишено съдържание на колаген (A). Имунохистохимичното оцветяване разкрива по-обилно разпределение на гладкомускулните клетки (В) и намалено натрупване на макрофаги (С) в брахиоцефални артериални лезии. Пръчките на скалата представляват 50 μm. L означава лумен. Данните са представени като средно ± SEM (n = 10 мишки/група). b P c P

TLR2 блокадата инхибира съдовото възпаление в атеросклеротичните артерии. Експресията на MMP-2 (A и B), NF-κB p65 фосфорилирането (C), Stat3 фосфорилирането (D) и експресията на цитокините IL-6, TNF-α и IL-10 (E) бяха намалени в TLR2ab -лечени и TLR2- дефицитни. Пръчките на скалата представляват 50 μm. Данните са представени като средно ± SEM (n = 6 мишки/група). b P

Диетата с висок холестерол (HC) увеличава експресията на TLR2 в макрофагите и TLR2 блокадата намалява индуцираната от HC експресия на CHOP и апоптоза при атеросклеротични лезии. (А) Оцветяването с Movat разкри морфология на плаката в брахицефалните артерии на мишки ApoE -/- Tlr2 +/+ и ApoE -/- Tlr2 -/-. Пръчките на скалата представляват 200 μm. Дефицитът на TLR2 значително намалява средната площ на лезията (B) и размера на некротичното ядро ​​(C) (n = 8 мишки/група). (D) Двойната имунофлуоресценция разкрива инфилтрация на TLR2-експресиращи макрофаги в лезии в брахиоцефалните артерии на мишки ApoE -/- на възраст от 12 до 24 седмици, които са поставени на атерогенни диети от 6-седмична възраст. Пръчките на скалата представляват 20 μm. На тази възраст ApoE -/- Tlr2 -/- мишки показват значително намалена експресия на CHOP (E), Bcl-2 (F) и разцепена каспаза-3 (G) в аортата. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 4-6 мишки/група). b P -/- мишки на същата възраст. e P -/- на възраст от 12 седмици за храна за хранене.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

дискусия

Възпалителните процеси играят ключова роля в развитието на атеросклероза. Доказано е, че TLR2 участва в този процес 11, 27. В съответствие с предишни проучвания на ранните етапи на атеросклероза, блокирането на активността на TLR2 намалява инфилтрацията на макрофаги в плаки; експресия на възпалителни медиатори, включително MMP-2, TNF-α и IL-6; и инактивиране на транскрипционния фактор NF-κB 20, 21, 23. В допълнение, антагонизмът на TLR2 също инхибира експресията на имуносупресивните медиатори IL-10 и транскрипционния фактор Stat3, което предполага, че ползите от блокирането на TLR2 зависят от широкото инхибиране на възпалението. Това проучване предоставя първите доказателства за TLR2-индуцирано възпаление при напреднали лезии, за да допълни разкритата преди това роля на TLR2 за ранна атеросклероза.

Нестабилността на плаката е важна характеристика на напредналата атеросклероза. Въпреки че механизмите, лежащи в основата на разкъсването на плаката, остават неуловими, много фактори са показали, че допринасят за този процес, включително натрупване на макрофаги, високи нива на провъзпалителни медиатори, свръхактивиране на MMP и апоптоза на VSMC и макрофаги. В допълнение към регулирането на възпалителните реакции, ние забелязахме, че TLR2 блокадата намалява апоптозата на макрофагите чрез TUNEL анализ и имунофлуоресценция.

В обобщение, ние демонстрирахме, че нокаутният ген на TLR2 при мишки ApoE -/- намалява размера на плаката и повишава стабилността на плаката в брахиоцефалната артерия по време на напреднала атеросклероза поради инхибиране на предизвиканото от ER възпаление и апоптоза на макрофагите. терапевтична стратегия срещу напреднала атеросклероза. Тъй като за иницииране на заболяването е необходима повишена експресия на TLR2 върху ендотелните клетки, TLR2 може да медиира или усилва предизвиканите от ER стрес апоптотични сигнали при напреднали атеросклеротични лезии. Нашата работа предполага, че фармакологичната блокада на сигнализирането на TLR2 е привлекателен подход за бъдещото лечение на атеросклероза.

Принос на автора

Проучването е проектирано от Xiao-xing WANG и Zhuo-wei HU; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV и Hui-min YAN допринесоха за развитието на методологията; Експериментите са извършени от Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU и Xiao-ming FU; Xiao-xing WANG и Zhuo-wei HU анализираха данните и написаха доклад.