елементи
абстрактно
Затлъстелите лица имат високи нива на глюкагон на гладно 1, 2 в допълнение към повишени концентрации на циркулиращ инсулин 1. Въпреки че е обърнато голямо внимание на повишените нива на инсулин, които ускоряват развитието на захарен диабет тип 2 (T2DM) 3, високите нива на глюкагон на гладно получават все по-голямо внимание като еднакво важно за прогресирането на заболяването до T2DM 4. При нормални обстоятелства повишаването на нивата на глюкозата има противоположни ефекти върху секрецията на инсулин и глюкагон от бета- и алфа-клетките, което е парадоксално при пациенти с T2DM, когато повишаването на нивата на глюкоза стимулира и двата хормона 5. Повишените нива на глюкагон задействат производството на чернодробна глюкоза, което води до по-голямо търсене на инсулин, което може да ускори стреса на бета-клетките и по този начин да допринесе за развитието на заболяването6.
Секрецията на гладно глюкагон и инсулин може допълнително да се регулира от паракринните ефекти, напр. Инхибиращи ефекти на инсулина върху алфа-клетките 20, 21, 22 и соматостатина върху алфа- и бета-клетките 23, 24. Въз основа на тези наблюдения, намаляването на секрецията на соматостатин може да допринесе за увеличаване както на секрецията на глюкагон, така и на инсулина. Степента, до която се наблюдава такова намаляване на освобождаването на соматостатин при условия на гладно, когато секрецията на глюкагон и инсулин се увеличава, е неизвестна.
Като се има предвид ситуацията при деца със затлъстяване със съпътстващо повишаване на инсулина и глюкагон 1 и повишени нива на FFA при нормални нива на глюкоза на гладно 25, нашата цел беше да проучим как хронично повишените нива на FFA влияят на секрецията на глюкагон, инсулин, а също и на соматостатин секреция от изолирани човешки островчета на гладно държава. концентрации на глюкоза със специален фокус върху ролята на FFAR1.
резултатът
Палмитатът увеличава базалната островна глюкагон и секрецията на инсулин чрез FFAR1
Ефект на палмитат върху натрупания глюкагон (панел А) и секрецията на инсулин (панел В) от изолирани човешки островчета, култивирани в продължение на 0,25 до 7 дни при 5,6 mM глюкоза в отсъствие (бели символи) или присъствие (черни символи) на палмитат със и без FFAR1 антагонист на ANT203. Клетъчното съдържание на глюкагон (панел С) и инсулин (панел D) в края на културата в островчета, третирани с палмитат със и без антагонисти на FFAR1 ANT203 и ANT825, беше представено като% от съдържанието на хормони в островчета, получили контролно лечение. Нива на иРНК на FFAR1 (панел E) и протеин (панел F) в островчета, третирани с палмитат и без FFAR1 антагонист ANT203. Нивата на транскрипт и протеин се изразяват като% от нивата в островчетата, които са получили контролно лечение. Резултатите показват средната стойност ± SEM на n = 3-5 експеримента от експерименти с донори. * P # p
Ефект от намаляването на експресията на FFAR1 върху натрупаната хормонална секреция от човешки островчета, култивирани при 5,6 mM глюкоза в отсъствие (бели стълбове) или присъствие на 0,5 mM палмитат (черни стълбове) за 1 ден. Относителни нива на FFAR1 mRNA (панел A) и общ FFAR1 протеин (панел B) в края на културата в сравнение с целевата shRNA, която не е бозайник (neg) или лечение с shfar-насочена shfar (Ffar1). Показани са натрупаните секрети на глюкагон (панел C), инсулин (панел D) и соматостатин (панел E). Резултатите показват средна стойност ± SEM и са от n = 3-5 експерименти с донори. * P # p
Ефект на FFAR1 и бета-окислението на мастни киселини върху базалния глюкагон (панели A, G), инсулина (панели B, H) и секрецията на соматостатин (панели C, I) и съдържанието (панели DF, F). Човешките островчета се култивират в продължение на 1 ден със или без агонисти на FFAR1; TAK-875, GW9508, TUG-499 в сравнение с палмитат (черни ленти) (панел A - C) и палмитат със и без ANT825 и/или етомоксир (панел G - I). Резултатите показват средна стойност ± SEM и са от n = 5 експеримента с донори. # Р 16, 26. Когато нашите резултати от това проучване показаха, че секрецията на островния хормон, засегната от палмитат чрез FFAR1 при базови концентрации на глюкоза, предположихме, че мастната киселина може да повлияе и на дишането при концентрации на глюкоза на гладно. Всъщност митохондриалното дишане беше намалено или чрез остро добавяне на ANT203 към островчета, изложени на 5,6 mM глюкоза и палмитат (фиг. 4А, В), или чрез включване на структурно различен антагонист ANT825 по време на култура на островчета в присъствието на 5,6 mM глюкоза и палмитат (фиг. 4C, D). Намаляването на митохондриалното дишане на ANT825 в присъствието на палмитат до голяма степен се дължи на намаляването на свързаното с АТР дишане (фиг. 4Е).
Ролята на FFAR1 и бета-окислението на мастни киселини в ефекта на палмитат върху секрецията и дишането на инсулин EndoC-pH1. Клетките бяха изложени на 5,6 mM глюкоза в отсъствие (бели символи) или присъствие (черни символи) на палмитат с ANT825 и/или етомоксир, триметазидин и без него. Инсулинова секреция (панел А). Представителни кинетични записи на OCR от клетки, остро изложени на палмитат с ANT825 и/или етомоксир (панел В). OCR за митохондрии (панел C), свързан с ATP OCR (панел D) и OCR за изтичане на протони (панел E). Резултатите показват средна стойност ± SEM (панели A, CE,) (n = 5) и средна стойност ± SD (панел B) (N = 6). * P # P & P 1, 2. В това проучване ние предоставяме доказателства, че подобно повишаване на двойния островен хормон може да е резултат от увеличени циркулиращи концентрации на FFA, което е характерно за тази група пациенти 25. По този начин нивата на глюкагон и инсулин на гладно може да се дължат на комбинация от активиране на FFAR1 и метаболизъм на островните клетки, а не само за компенсиране на инсулиновата резистентност. Разбирането на механизмите, чрез които FFAs предизвикват засилена базална секреция на хормоните на островчетата, е от решаващо значение за спирането на този порочен кръг.
Резултатите от това проучване са получени от in vitro експерименти и не могат да бъдат директно прехвърлени в in vivo среда със сложност, включваща например инкретини, невронална активност и различни FFA, които модулират секрецията на инсулин и глюкагон. Резултатите обаче показват механизма, чрез който повишената циркулираща FFA и триглицеридите могат да доведат до съпътстващо повишаване на базалния тонус на секреция на глюкагон и секрецията на инсулин на гладно, което може да наруши контрола на глюкозата в хронична ситуация.
За да обобщим, заключаваме, че FFA са регулатори на секрецията не само на инсулин, но и на глюкагон и соматостатин при концентрации на глюкоза на гладно от човешките островчета и че FFAR1 е от решаващо значение в това отношение. Тоест ефектът на FFAR1 върху секрецията на хормони не се ограничава до усилване при повишени концентрации на глюкоза, както беше обсъдено по-рано, а по-скоро зависи от горивния субстрат. Следователно, ние предполагаме, че ендогенните FFAR1 лиганди могат да подобрят освобождаването на инсулин и глюкагон при концентрации на глюкоза на гладно чрез тяхната двойна роля като активатори на рецептори и метаболити на горивата.
Материали и методи
Човешки панкреатични островчета
Човешките островчета са получени от умрели в мозъка иначе здрави индивиди без известни метаболитни заболявания от Отдела за трансплантация на островчета в Университета Упсала и Prodo Lab Inc. (Ървайн, Калифорния, САЩ). Етично одобрение за употреба и процедури и протоколи за боравене с островчета, изолирани от индивиди, са получени от Регионалния съвет за преглед на етиката в Упсала, Швеция (EPN номер 2010/006; 2010-02-10). Всички процедури, включващи островчета, са извършени в съответствие с горното одобрение, както и в съответствие с приложимите местни директиви и разпоредби. Писменото информирано съгласие на всички дарители е предоставено и документирано от отделни дарители или членове на техните семейства. Получаването и документирането на писмено съгласие за дарение на островчета за изследвания е извършено в съответствие с гореспоменатото одобрение на Регионалния съвет за преглед на етиката в Упсала, Швеция, както и в съответствие с приложимите местни разпоредби и насоки. Като цяло бяха използвани островчета от 19 донори, които не са диабетици. Островчетата се култивират в среда CMRL 1066, съдържаща 5,6 mM глюкоза и допълнени с 10% FBS (Invitrogen, Paisley, UK), наричани по-долу като контролни условия. Експериментите започват 3 - 7 дни след изолирането.
EndoC-pH1 клетки
EndoC-pH1 27 клетки се отглеждат върху 1% гел на извънклетъчната матрица и 2 μg/ml покрити с фибронектин ястия с култура в DMEM, съдържащи 5,6 mM глюкоза, 2% фракция на говежди серумен албумин (BSA) без мастни киселини (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия).). ), 10 mM никотинамид, 50 μM 2-меркаптоетанол, 5,5 μg/ml трансферин, 6,7 ng/ml натриев селенит, 100 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин. Освен ако не е посочено друго, всички химикали са получени от Sigma Aldrich.
Обработка на островчета и EndoC-pH1 клетки с дълговерижна мастнокиселина палмитат
Измерване на хормонален секрет и съдържание
Концентрациите на глюкагон, инсулин (Mercodia AB, Uppsala Швеция) и соматостатин (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, USA) в хранителната среда и в пробите от клетъчен лизат бяха измерени чрез ELISA. Съдържанието на хормон се нормализира до общото съдържание на протеин, измерено чрез DC протеинов анализ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) и след това се представя като многократно контролно лечение.
Намаляване на FFAR1 shRNA
Използвана е къса шпилка РНК (обобщена) от FFAR1 за инхибиране на експресията на FFAR1 и е приложена с SHCLNV VSV-G трансфер на лецивирусни частици (мисия за трансдукция на частици, Sigma Aldrich), която съдържа обобщено насочване на Ffar1/Gpr40 с последователност CCGGCGCCTCGGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTT Приблизително 50 островчета бяха трансдуцирани във всяка ямка (96-ямкова плака без тъканна култура) с 2-5 x 106 TU трансдуциращи частици в 50 μl от 1: 1 смес от DMEM, смесена с CMRL хранителна среда (без FBS без BSA) за 2 часа, както е описано по-горе. След това се добавят още 150 μl хранителна среда и сместа се оставя да се инкубира в продължение на 22 часа. Впоследствие средата беше заменена с 200 μL CMRL среда. Въз основа на прогнозното лечение с оборот на рецепторите, 3 дни след началото на трансфекцията и пробите, взети 2 дни след началото на лечението с палмитат, са започнали.
Измерване на нивото на иРНК FFAR1 чрез PCR в реално време
Обща тРНК беше изолирана от островни клетки, използвайки NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel, Duren, Германия) и обратна транскрипция в cDNA, като се използва системата за синтез на първа верига SuperScript-III за RT-qPCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). PCR в реално време се извършва в обем от 10 μl, като се използва Dynamo Capillary SYBR Green qPCR комплект (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). За амплификация бяха използвани следните праймери: FFAR1 (праймер, 5'-ATCACAGCCTTCTGCTAC и обратен праймер, 5'-CCTAGATTGGGGTACAGG), β-актин (праймер, 5'-ACGTGGACATCCGCAAAGAC) и (обратен праймер, 5T-CCTGTC CCT Нивото на иРНК на FFAR1 беше нормализирано към референтния ген на β-актин, използвайки следната формула: целево количество = 2-AACt, където AACt = [Ct (GPR40 KO) - Ct (β-актин KO)] - [Ct (GPR40 контрол) Ct (β-актинов контрол)] 55 .
Измерване на нивото на FFAR1 протеин чрез ELISA
Приблизително 100-500 изолирани човешки островчета бяха събрани след култивиране и измити три пъти с ледено студен PBS. Клетките се лизират в 100 μl 1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) в PBS. Лизатите претърпяха пет цикъла на бързо замразяване и размразяване, за да увеличат количеството мембранно свързани протеини. Общият FFAR1 в проби от лизат беше измерен чрез търговски човешки FFAR1/GPR40 Sandwich ELISA (LS-F8454, LifeSpan BioSciences, WA, USA) в съответствие с инструкциите на производителя. Клетките HEK293 бяха използвани като отрицателна контрола и показаха ниска реактивност в отговор в сравнение с EndoC-pH1 клетки (виж Допълнителна фигура SI).
Клетъчно дишане
Митохондриалното дишане на изолирани човешки островчета и EndoC-pH1 клетки се определя чрез измервания на OCR в анализатор на извънклетъчен поток XF96e (Agilent Technologies). Тестовете се провеждат в минимална среда за анализ на XF (Agilent Technologies), регулирана до рН 7,4 и допълнена с 5,6 mM глюкоза. И двете островчета (10-30 на гнездо и 10 гнезда за всяко състояние (N = 10)) и EndoC-pH1 клетки бяха поставени в 96 гнезда (60 000 клетки на гнездо и поне 6 гнезда за всяко състояние (N = 6 ).)) предварително покрити (виж по-горе) културни плочи. Функцията на митохондриите се определя чрез измерване на базално дишане, свързано с АТР дишане, изтичане на протони, максимален дихателен капацитет чрез добавяне на инхибитори на електронната транспортна верига олигомицин (2 μM), ротенон (5 μM) и антимицин (5 μM), както и йонофор. FCCP (2 μM), както е описано по-горе 16. Базалният OCR се измерва след 2 часа култивиране. Всички измервания на OCR бяха коригирани за немитохондриален OCR. Освен ако не е посочено друго, всички химикали са получени от Sigma Aldrich.
Статистически анализ
Анализът беше извършен с помощта на софтуера Graph Pad Prism, версия 6 (Сан Диего, Калифорния, САЩ). За статистически анализ бяха използвани сдвоени t-тестове и повтарящи се еднопосочни ANOVA (с Fisher LSD post-hoc тест). P