елементи
абстрактно
Сухожилията са плътни съединителни тъкани, съставени главно от тип I колаген, които предават сили между мускулите и костите и са необходими за двигателната структура.
Захарният диабет тип II (T2DM) е метаболитно заболяване, характеризиращо се с хипергликемия и намалена инсулинова чувствителност 1 и е силно свързано със затлъстяването 2. Въпреки че е трудно да се откъснат системните ефекти на диабет тип II от затлъстяване, ясно е, че предизвикването на затлъстяване/T2DM води до тежки промени в метаболитната функция, което води до различни патологични промени в тялото 3 .
Понастоящем се знае много малко за клетъчните и молекулярните механизми, лежащи в основата на диабетната тендинопатия, въпреки че патологичните промени се увеличават в зависимост от продължителността на T2DM 6. За да започнем да се справяме с тази празнина в знанията, използвахме миши модел на диета, предизвикано от затлъстяване и диабет тип II 14, за да тестваме хипотезата, че сухожилията на флексорите при затлъстели/диабетични мишки ще бъдат прогресивни, патологични промени във функцията на сухожилията и механичните свойства Също така изследвахме ефектите от нормалната метаболитна функция върху възстановяването като потенциално средство за обръщане или спиране на диабетната тендинопатия. И накрая, поради загубата на инсулинова чувствителност, наблюдавана при затлъстели/T2DM сухожилия, генерирахме специфични за сухожилията инсулинови рецептори (IR), обусловени в нокаутиращи мишки, за да определим дали IR делецията в сухожилието е достатъчна, за да рекапитулира фенотипа на диабетната тендинопатия.
резултатът
HFD предизвиква затлъстяване и диабет тип II при мишки
HFD мишките имат значително увеличение на телесното тегло в сравнение с LFD и HFD-LFD във всички времеви точки (24 седмици - LFD: 33, 75 g ± 2, 27, HFD: 49, 05 g ± 2, 24; HFD-LFD: 28, 8 g ± 7,03, стр 
T2DM/затлъстяването променя функцията на сухожилията и механичните свойства. ( A ) Измерване на ъгъла на огъване на ставите на метакарфалангеалната (MTP) става, ( Б. ) Съпротивление на плъзгане, ( ° С ) Максимално натоварване при повреда и ( д ) Скованост на сухожилията на FDL в сухожилията на LFD, HFD и HFD-LFD между 12 и 48 седмици след началото на диетата. * Показва стр
T2DM/затлъстяването променя диаметъра на колагеновите фибрили. ( A ) TEM аксиални изображения на FDL сухожилие от LFD, HFD и HFD-LFD мишки 40 седмици след началото на диетата. Липидните отлагания в HFD сухожилията са обозначени с черни стрелки. Скалата представлява 5 микрона в изображения с увеличение от 3500x и 0,5 микрона в изображения с увеличение от 40 000x. ( Б. ) Хистограми с диаметър на колагеновите фибрили, показващи намаляване на средния диаметър на фибрилите в HFD и HFD-LFD сухожилията в сравнение с LFD. ( ° С ) Разпределение на диаметъра на колагеновите фибрили със сливания в кутия, които припокриват данните между 5-ия и 95-ия процентил. Данните извън този диапазон се нанасят като отделни точки. ( д ) Колагенова плътност на фибрилите. * Обозначава p15 Изследвахме промени в активирането на сигнализирането на инсулиновия рецептор (IR) в първични теноцити и сухожилия на затлъстели/T2DM и недиабетни мишки. Първичните теноцити демонстрират стабилно активиране на IR сигнализация, както е показано чрез повишена експресия на β-Akt в сравнение с третирани с носител теноцити (Фиг. 4А). След инсулинова стимулация, сухожилията от LFD мишки демонстрират силна индукция на експресия на β-Akt, което показва активиране на IR сигнализация. За разлика от това, индукцията на p-Akt е притъпена в HFD сухожилията (фиг. 4В).
Експресията и сигнализирането на инсулиновия рецептор се променят в сухожилията на диабета. ( A ) Първичните теноцити, изолирани от недиабетни сухожилия на мишки, демонстрират силна експресия на β-Akt спрямо третираните с носител теноцити, което показва активиране на IR сигнализация в теноцити. ( Б. ) Сухожилията от HFD и LFD мишки бяха стимулирани с инсулин или носител (0.5% BSA в PBS). Активиране на IR сигнализация се наблюдава в LFD сухожилия поради повишена експресия на β-Akt. За разлика от това, не се наблюдава повишаване на експресията на β-Akt в инсулино-стимулирани HFD сухожилия в сравнение с лечение с носител, което показва вцепенена инсулинова чувствителност в HFD сухожилия. Петната бяха изследвани за β-Akt и показани, след отстраняване на мембраната, същите петна бяха изследвани за общия Akt. Блоковете с пълна дължина са показани на допълнителна фигура 1.
Изображение в пълен размер
S100a4-Cre води до намаляване на експресията на инсулиновия рецептор в сухожилието
Поради загубата на чувствителност към инсулин при затлъстели/T2DM миши сухожилия и увеличаването на експресията на IRp в човешките T2DM сухожилия, ние изследвахме ефектите от делецията на IRp в сухожилията, използвайки S100a4-Cre. За да се демонстрира, че S100a4-Cre ефективно насочва резидентни теноцити, S100a4-Cre +; Използвани са репортерски мишки Ai9. Експресия на флуоресценция A19 се наблюдава в почти всички резидентни теноцити (фиг. 5А). В допълнение, Western blot анализи показват намаляване на експресията на IRp в S100a4-Cre +; IR F/F мишки (IRcKO S100a4), в сравнение със стандартните (WT) братя и сестри (Фиг. 5В). Не са наблюдавани промени в процента на телесните мазнини (фиг. 5С), телесното тегло (фиг. 5D) или кръвната глюкоза на гладно (фиг. 5Е) между WT и IRcKO S100a4 мишки. Преходно повишаване на глюкозния толеранс се наблюдава при IRcKO S100a4 мишки 30 минути след прилагане на глюкозен болус, но не се наблюдава разлика в глюкозния толеранс след 15, 60 или 120 минути (фиг. 5F). Значително, 23% намаление на площта под кривата се наблюдава при мишки IRcKO S100a4 по време на теста за глюкозен толеранс (Фиг. 5G). По този начин IRcKO S100a4 позволява да се изследват специфичните ефекти на IRP нокаута при независими от затлъстяване сухожилия/T2DM.
Изтриването на IRp в S100a4 клетки не предизвиква затлъстяване или T2DM. ( A ) Ефективността на рекомбинацията на S100a4-Cre в сухожилията е визуализирана с помощта на репортера A19 и е показана ефективна рекомбинация в сухожилието. ( Б. IRcKO S100a4 намалява експресията на IRp протеин в сухожилието, в сравнение с WT. Блоковете с пълна дължина са показани на допълнителна фигура 2. ( ° С - Е. ) Не са наблюдавани промени в телесното тегло между WT и IRcKO S100a4 мишки ( ° С ), ( д ) процент на телесни мазнини или в кръвта ( Е. ) в кръв на гладно след 48 седмици. Възраст. ( F - G ) IRcKOS100a4 имаше по-ефективно възстановяване на кръвните нива по време на теста за глюкозен толеранс ( F ) и както се изчислява чрез количествено определяне на площта под кривата от теста за глюкозен толеранс ( G ).
Изображение в пълен размер
Делецията на инсулиновия рецептор в S100a4-линейни клетки не предизвиква диабетна тендинопатия
Сухожилията IRcKO S100a4 имаха значително увеличение на ъгъла на огъване на MTP (49, 87 ° ± 1, 79, p = 0,02) след 48 седмици спрямо WT (42, 37 ° ± 2, 16) (фиг. 6А). Не се наблюдава промяна в съпротивлението на приплъзване между WT и IRcKO S100a4 (WT: 19, 02 ± 2; 1; IRcKO S100a4: 17, 73 ± 1, 87, p> 0,05) (Фиг. 6В). Максималното натоварване на повреда и твърдост не се различава значително между IRcKO S100a4 и WT сухожилия (Макс. Натоварване: WT: 5, 92 N ± 0, 74, IRcKO S100a4: 6, 9 N ± 0, 7, p = 0, 36) (Фиг. 6C, D). В допълнение, TEM анализите показват, че загубата на IRp в клетките S100a4 не променя разпределението на диаметъра на колагеновите фибрили (медиана WT: 188, 63; медиана IRCKO S100a4: 193, 32, p = 0.21) (фиг. 6E-G) или фибрилите на плътността (Фиг. 6Н) (р = 0, 82) на 48-седмична възраст.
Изтриването на IRp в S100a4-родословни клетки не нарушава функцията на плъзгащото сухожилие, механичните свойства или организацията на колагена. ( A ) MTP ROM, ( Б. ) Устойчивост на плъзгане, ( ° С ) Макс. Натоварване при повреда и ( д ) Сковаността се оценява на 48-седмична възраст в сухожилията WT и IRcKO S100a4. * Показва p S100a4 на възраст 48 седмици. ( F ) Не са наблюдавани промени в диаметъра на колагеновите фибрили между сухожилията WT и IRcKO S100a4. ( G ) Разпределение на диаметъра на колагеновите фибрили с термоядрени синтези, обхващащи данни между 5-ия и 95-ия процентил. Данните извън този диапазон се нанасят като отделни точки. ( З. ) Колагенова фибрилна плътност на TEM изображения на WT и IRcKO S100a4 сухожилия на мишки на възраст 48 седмици.
Изображение в пълен размер
дискусия
Механичните свойства на сухожилието и ROM зависят от организацията на колаген ECM 20. Поради намаляването на механичните свойства на сухожилията от HFD и HFD-LFD мишки, ние изследвахме промените в организацията на колаген и диаметъра на фибрилите. TEM показва значителни промени в разпределението на диаметъра на колагеновите фибрили в HFD и HFD-LFD сухожилията в сравнение с LFD. Тези наблюдавани промени в размера на фибрилите могат да повлияят на плъзгащата се функция на сухожилията и предполагат променена архитектура на колагеновите фибрили като механизъм на нарушена функция на сухожилията при диабетна тендинопатия. Съответно, клинично се наблюдава увеличаване на обема на сухожилията при пациенти с диабет тип II 21, което предполага, че загубата на компактност на колагена може да попречи на нормалната плъзгаща функция, водеща до намалена функция на сухожилията и обхват на движение.
Накратко, затлъстяването/T2DM е достатъчно, за да предизвика необратима каскада от патологични промени в сухожилието на флексора, включително променена организация на ECM, което в крайна сметка води до намалени механични свойства и сухожилие ROM. В допълнение, изтриването на IRp в клетките с линия S100a4 не променя организацията на сухожилията на ECM или функцията на сухожилията. Като се има предвид, че се наблюдава намалена инсулинова чувствителност при сухожилия със затлъстяване/T2DM, по-нататъшното изследване на ролята на IRp в други клетъчни популации ще бъде важно. И накрая, диференциацията на метаболитната дисфункция не е била достатъчна, за да предотврати прогресирането на заболяването на сухожилията, което предполага, че разбирането на специфичните за сухожилията клетки и молекулярният отговор на затлъстяването/T2DM ще бъде от решаващо значение за успешното управление и лечение на диабетната тендинопатия.
методи
Етика на животните
Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките на Наръчника на Националния здравен институт за грижи и употреба на лабораторни животни. Всички процедури с животни са одобрени от Университетския комитет за изследване на животните (UCAR) към Университета в Рочестър (UCAR номер: 2014-004).
Диета-индуцирано затлъстяване и диабет тип II
Мъжки мишки C57B1/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) бяха настанени в групи от по пет на 12-часов цикъл светлина/тъмнина. След четири седмици мишките бяха поставени на диета с ниско съдържание на мазнини (LFD; 10% Kcal, Research Diets # 12450 J) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD; 60% Kcal, Research Diets # D12492) за период до 48 седмици. Трета кохорта (HFD-LFD) от мишки се поставя върху HFD за 12 седмици и след това се променя на LFD до жертвата (Фиг. 1А). Мишките бяха умъртвени на 12, 24, 40 и 48 седмици след началото на диетата, чрез вдишване на въглероден диоксид и цервикална дислокация.
Инсулиновите рецептори медиират делецията на мишки
За да се контролира загубата на IRp в благородството, IRp флокс/флокс (# 6955, Jackson Laboratories) 29 бяха кръстосани с мишки S100a4-Cre (# 12641, Jackson Laboratories), за да се получат IRcKO S100a4 мишки. произведени ко-; IRp flox/flox братя и сестри бяха използвани като контроли от див тип (WT). За да се потвърди ефективно насочване на сухожилията, мишките S100a4-Cre бяха кръстосани с репортерни мишки Ai9 (# 7909, Jackson Laboratories) 30, което доведе до флуоресценция на tdTomato след рекомбинация, медиирана от Cre. Мишките са били жертвани на 48-седмична възраст.
Измерване на глюкозата на гладно
На 12, 24, 40 и 48 седмици след началото на диетата, мишките (n = 6 на диета за времева точка) са гладували в продължение на пет часа 31, претеглят се и се измерват нивата на кръвната захар на гладно с помощта на глюкомер OneTouch2 (LifeScan Inc., Milpitas, CA). Глюкозата в кръвта на гладно се измерва на 48 седмична възраст при мишки IRcKO S100a4 и WT (n = 6 за генотип).
Тест за толерантност към глюкоза
За да се определи глюкозният толеранс 20 седмици след началото на диетата, LFD, HFD и HFD-LFD мишки (n = 6 на диета) получават 10 μl/g болус от 20% глюкоза в PBS чрез интраперитонеално инжектиране бързо след пет часа. Нивата на кръвната глюкоза се измерват на 15, 30, 60 и 120 минути след глюкозния болус. Глюкозният толеранс се оценява на 48-седмична възраст при IRcKO S100a4 и WT мишки.
Оценка на телесните мазнини
На 12 и 48 седмици след началото на диетата (48-седмична възраст при мишки IRcKO S100a4 и WT), процентът на телесните мазнини се измерва с помощта на двуенергиен рентгенов абсорбер PIXImus (DXA) (GE Lunar PIXImus, GE Healthcare, WI ). ).
Оценка на функцията на платно
След жертвоприношение, задните крайници бяха събрани за плъзгане и биомеханични тестове на 12, 24, 40 и 48 седмици след началото на диетата (n = 6 - 10 на диета за времева точка). IRcKO S100a4 и WT мишки бяха събрани на 48-седмична възраст (n = 8-10). Сухожилието на FDL е изолирано от миотендозния възел в тарзалния херпесен тунел, оставяйки сухожилието непокътнато през цифрите. Проксималният край на сухожилието е закрепен между две парчета лента с помощта на цианоакрилат. Тибията е била закрепена със собствения си захват и проксималният край на FDL е бил зареждан постепенно от 0 до 19 g. След прилагане на всяка тежест е направено изображение на флексията на ставите на метатарзофалангалната (MTP) става и е измерено с помощта на ImageJ (//imagej.net). Използвайки тези цифри, ъгълът на огъване MTP се изчислява като разликата в ъгъла на огъване MTP между ненатовареното (0 g) и 19 g. Съпротивлението на приплъзване се изчислява чрез поставяне на данните за отклонението в еднофазно експоненциално уравнение. Нелинейна регресия беше използвана за определяне на устойчивост на приплъзване 32 .
Биомеханично изпитване на опън
След тестване на плъзгаща функция, FDL беше освободен от тарзалния тунел и пищялът беше отстранен. Проксималният край на FDL и цифрите се държат в противоположни самозахващания в инструмент на Instron (система за аксиално сервохидравлично тестване Instron 8841 DynaMight, Instron Corporation, Norwood, MA). Сухожилието е изместено в напрежение с 30 mm/минута до повреда. Твърдостта и максималното натоварване при разрушаване се изчисляват от кривата на изместване на силата.
Трансмисионна електронна микроскопия
FDL сухожилията бяха изолирани (n = 3 на диета или генотип) и фиксирани в фиксатора на глутаралдехид натриев какодилат. Една микронна аксиална секция беше изрязана и оцветена с толуидиново синьо. След това един микронен разрез се нарязва на 70 nm и се оцветява с уранилацетат и оловен цитрат. Секции бяха поставени върху образни решетки на аналитичен ТЕМ на Hitachi 7650. Осем до дванадесет изображения, които не се припокриват, са направени от средното вещество на всяко сухожилие при увеличение 15 000x и 40 000x. За да се измери диаметърът на фибрилите, във всяко изображение беше определена зона на интерес (ROI), така че да могат да бъдат измерени минимум 80 фибрили. Средните стойности бяха измерени по оста y. Плътността на колагена е измерена в площ от 2340 x 1860 пиксела. Измерванията на плътността и диаметъра на колагеновите фибри бяха извършени в ImageJ.
Експресия и сигнализация на инсулиновия рецептор
Първични теноцити бяха изолирани от мишки C57B1/6 J и използвани до пасаж 3. Цели FT бяха изолирани от мишки, хранени с HFD и LFD, 48 седмици след началото на диетата (n = 3 на група). Теноцитите и сухожилията се стимулират или с носител (0.5% BSA в PBS), или с 1 nM инсулин за 15 минути, последвано от изолиране на протеини за Western blot анализи. Блотите бяха изследвани за фосфо-AKT Ser473 (1: 1000, клетъчна сигнализация, # 4060) и за обща AKT (1: 1000, клетъчна сигнализация, # 9272 S) 33 и разработени с SuperSignal West Pico или Femto хемилуминесцентен субстрат и показани на GelDocXR (BioRad, Херкулес, Калифорния). За да се оценят промените в експресията на IRp при мишки IRcKO S100a4, общият протеин се екстрахира от сухожилията WT и IRcKO S100a4 (n = 3 за генотип) за Western blot анализи. Блотите бяха изследвани с IRp (1: 300, Santa Cruz, # sc-20739) 34 и β-актин (1: 2500, Sigma Aldrich, # A2228) 35 и разработени с SuperSignal West Pico или Femto хемилуминесцентен субстрат и изобразени на GelDocXR ( BioRad, Херкулес, Калифорния).
Статистически анализи
При проучвания за затлъстяване/T2DM телесното тегло, нивата на кръвната захар, биомеханичните и плъзгащите се данни се анализират чрез двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от множествено сравнение на Bonferroni със значимост, определена при a = 0,05. еднопосочна ANOVA с множество сравнения на Bonferroni post-hoc. Статистическите разлики между WT и IRcKO S100a4 бяха определени с помощта на несдвоени t-тестове. Всички данни бяха анализирани със статистически софтуер Prism GraphPad 7.0. Данните са представени като средно ± SEM.
Наличност на данни
Тази статия включва всички данни, генерирани или анализирани по време на това проучване.
Благодаря
Бихме искали да благодарим на хистологията, биохимията и молекулярното изобразяване (HBMI) на ядрото и биомеханиката, биоматериалите и мултимодалните тъканни изображения (BBMTI) на ядрото в Центъра за опорно-двигателния апарат, многофотонното ядро за изображения и ядрото за електронна микроскопия в Университета Рочестър Медицински. Център за техническа помощ. Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства на NIH/NIAMS K01AR068386 (AEL), P30 AR061307 Pilot (AEL), R01 AR073169 (AEL), R01 AR070765 (MRB) и наградата на университета в Рочестър (AEL & MRB). KM се поддържа от 3T32 AR053459-10S1. Ядрото за хистологични, биохимични и молекулярни образи (HBMI) и биомеханика, биоматериали и ядро за мултимодална тъкан (BBMTI) са частично подкрепени от P30 AR069655. Съдържанието е единствена отговорност на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на Националните здравни институти.
Електронен допълнителен материал
Допълнителна информация
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.