възпаление

  • абстрактно
  • Основното
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • Приготвяне на суспензия от екстракт от боровинки и ендотоксин
  • Животни и лечение
  • електроретинограма
  • Имуноблот анализи
  • Измерване на дължината на външния сегмент
  • Количествена RT-PCR в реално време
  • ROS измерване
  • Статистически анализи
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Защитен ефект на богатия на антоцианин екстракт от боровинка върху зрителната функция по време на EIU
  • Поддържане на нива на родопсин с богат на антоцианин екстракт от боровинки по време на EIU
  • Инхибиращ ефект на богатия на антоцианин екстракт от боровинки върху индуцираното от ретината активиране на STAT3 от EIU
  • Потискане на провъзпалителния цитокин от богат на антоцианин екстракт от боровинка в ретината с помощта на EIU
  • Намаляване на оксидативния стрес чрез богат на антоцианин екстракт от боровинка в ретината с помощта на EIU
  • Потискане на NF-kB B чрез богат на антоцианин екстракт от боровинка в ретината с помощта на EIU
  • ДИСКУСИЯ

абстрактно

Основното

Последният технологичен напредък доведе до синтеза на медицински полезни химични съединения. От друга страна, има дълъг исторически прецедент за развитието на лекарства от живи същества, често под формата на растителни екстракти. Например дигиталис, сърдечно лекарство, се появява за първи път в листата на цветето дигиталис (Digitalis purpurea L.), 1 и морфинът, аналгетик, е открит в опиумния мак (Papaver somniferum L.). 2

Тук се фокусираме върху годни за консумация плодове, боровинки (Vaccinium myrtillus L.), които съдържат богати антоцианини. Антоцианините са водоразтворими гликозиди на антоцианините, които са производни на катиони на флавилий. В боровинките има 15 различни антоцианини. 3 Предишни доклади предполагат, че антоцианините са отговорни молекули за основните фармацевтични ефекти на боровинките, включително антиоксидантната активност, 4, 5, 6 и способността му да изчиства свободните радикали. 7 Екстрактът от боровинки, богат на антоцианин, отдавна е популярно лечение при различни очни състояния. Например, смята се, че подобрява нощното зрение, за което са проведени клинични изпитвания. 8 Този екстракт също така предотвратява катаракта и глаукома. 9 Въпреки това степента на въздействието му върху зрителната функция и основните биологични механизми не е изяснена.

Прекомерният оксидативен стрес унищожава тъканите при различни заболявания, включително невродегенеративни заболявания като амиотрофична странична склероза, 10 сърдечно-съдови заболявания, 11 и рак. 12 Очните заболявания, включително свързаната с възрастта дегенерация на макулата13, също са следствие от оксидативен стрес, причинен от свръхпроизводството на реактивни кислородни видове (ROS). Тъй като антиоксидантът, екстракт от боровинки, богат на антоцианини, може да има ефект върху защитата на тъканите, той може да има фармацевтични приложения за превантивно лечение на хора.

По-рано показахме, че някои растителни молекули могат да предотвратят или облекчат увреждането на ретината: лутеинът предотвратява дисфункцията на нервите, а ресвератролът предотвратява съдовата дисфункция на ретината в миши модел на ендотоксин-индуциран увеит (EIU). 14, 15 В този модел вроденият имунитет причинява нарушена зрителна функция, което може да се види чрез електроретинограма (ERG), 15, 16, 17 и ненормална адхезия на левкоцитите, която е свързана с анормална циркулация, причинена от възпалителни цитокини, произведени в ретината. 18 ERG на тези мишки показва нарушена функция на фоторецепторните клетки, което е свързано с прекомерно разграждане на родопсин, STAT3-зависим визуален агент. 17, 19

В това проучване разкрихме биологичните ефекти на богатия на антоцианин екстракт от боровинка върху зрителната функция на EIU мишки, както и върху неговия молекулярен механизъм. Нашите открития подкрепят потенциалното бъдещо използване на този екстракт като превантивна терапия.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Приготвяне на суспензия от екстракт от боровинки и ендотоксин

Екстрактът от боровинки (съдържащ около 39% антоцианини), предоставен от Wakasa Seikatsu (Киото, Япония), се суспендира във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) при концентрация от 50 mg/ml. Липополизахарид (LPS) от Escherichia coli 055: B5 (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ) се разтваря в PBS при концентрация 1 mg/ml.

Животни и лечение

C57BL/6 мишки (на 6 седмици) бяха закупени от CLEA Japan (Токио, Япония) и поставени в климатизирана стая (23 ± 1 ° C) в цикли на тъмнина/12 часа светлина (светлина от 8:00) до 20: 00), със свободен достъп до стандартна храна (CLEA Япония) и чешмяна вода. Мишките бяха разделени на случаен принцип в три групи. Мишките бяха богати на богат на антоцианин екстракт от боровинки (500 mg/kg телесно тегло) за групата на боровинките или PBS за контролната група и групите носители. Мишките бяха прилагани орално в продължение на 4 дни. 3 часа след последното приложение, групата с носител и боровинки получиха една интраперитонеална инжекция на LPS (6,0 mg/kg телесно тегло), за да се създаде EIU модел, докато PBS беше инжектирана в контролната група. Мишките бяха оценени на 1,5 (за измерване на фосфорилиран NF-кВ) и 24 (за други) h след инжектиране на LPS или PBS, когато са очевидни патологични промени в ретината. 15, 20 Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с декларацията ARVO относно използването на животни в офталмологични и визионерски изследвания.

електроретинограма

Мишките бяха адаптирани към тъмнината в продължение на поне 12 часа, приготвени под слаба червена светлина и обезболени със 70 mg/kg телесно тегло натриев пентобарбитал (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Осака, Япония) По време на експеримента те бяха поставени върху нагревателна подложка. Студентите бяха разширени с една капка смес от 0,5% тропикамид и 0,5% фенилефрин (Santen Pharmaceutical, Осака, Япония). Заземеният електрод поставя иглата подкожно в опашката, а референтният електрод се поставя в устата. Активните електроди бяха златни проводници, поставени върху роговицата. Направени са записи (PowerLab System 2/25; AD Instruments, NSW, Австралия) и реакциите са диференциално усилени и филтрирани през дигитален лентов филтър в диапазона от 0,313 до 1000 Hz за получаване на α- и β-вълни. Светлинни импулси с продължителност 800 cd · s/m 2 и 4 ms са доставени с търговски стимулатор (Ganzfeld System SG-2002; LKC Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Импедансът на електрода се проверява преди и след всяко измерване на всички животни, използвайки вградената функция на инструмента. Времето по подразбиране на α- и β-вълните се измерва от началото на стимула до пика на всяка вълна. Амплитудата на a-вълната се измерва от базовата линия до коритото на a-вълната и амплитудата на b-вълната се измерва от коритото на a-вълната до пика на b-вълната.

Имуноблот анализи

Измерване на дължината на външния сегмент

Ретините (10 μm) бяха фиксирани в 4% параформалдехид и оцветени с хематоксилин и еозин (HE), а дължината на външния сегмент (OS) беше измерена в задната ретина в четири точки, две от двете страни на зрителния нерв на разстояние 200 и 500, хм с помощта на ImageJ и осреднено. Всички секции бяха изследвани под микроскоп, оборудван с цифрова камера (BIOREVO BZ-9000, Keyence, Осака, Япония).

Количествена RT-PCR в реално време

Ретината се поставя в реагент TRIzole (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) за извличане на обща РНК. Допълнителна ДНК (cDNA) се приготвя чрез добавяне на 1 μg обща РНК към високопроизводителен RNA-k-cDNA Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и се транскрибира обратно в съответствие с инструкциите на производителя. Нивата на родопсин, интерлевкин-6 (IL-6) и TNF-α иРНК са нормализирани до нивата на иРНК на GAPDH. PCR се извършва с помощта на PCO система в реално време StepOnePlus (Applied Biosystems) и методът делта делта CT се използва за количествено определяне на генната експресия. Използвани са следните генно-специфични праймери: родопсин напред: 5'-GCTTCCCTACGCCAGTGTG-3 'и обратен: 5'-CAGTGGATTCTTGCCGCAG-3'; il-6 напред: 5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3 'и назад: 5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3'; tnf-a напред: 5'-ACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3 'и назад: 5'-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3'; и празнина напред: 5'-TGTCTTCACCACCATGGAGA-3 'и назад: 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3'.

ROS измерване

Протоколът за измерване на ROS се основава на публикуван метод 22 с някои модификации. Очите бяха енуклеирани и незабавно замразени в OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA). Нефиксираните криосекции (10 μm) се инкубират с 5 μM дихидроетидий (DHE; Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, USA) в продължение на 10 минути при стайна температура. DHE реагира с вътреклетъчния супероксиден анион и се превръща в ядрото на червеното флуоресцентно съединение етидий. Разрезите бяха изследвани с помощта на микроскоп, оборудван с цифров фотоапарат (BIOREVO BZ-9000, Keyence) при същите условия на експозиция, а интензивността на оцветяване във вътрешния плексиформен слой (INL) беше измерена в задната ретина в четири точки, две на от двете страни на зрителния нерв. На разстояние 200 и 500 μm, използвайки ImageJ и осреднено.

Статистически анализи

Стойностите бяха изразени като средни стойности ± sd. Използва се несдвоен t-тест на Student, за да се оцени статистическата значимост на разликите. P

Защитен ефект на богатия на антоцианин екстракт от боровинка върху зрителната функция по време на EIU. Представителни отговори на отделните мишки във всяка група ( а ). Намаляване на амплитудата на вълната ( б ) и b-вълни ( ° С ) по време на EIU беше значително потиснат от богатия на антоцианин екстракт от боровинка. Времето на вълната по подразбиране не се е променило ( д ). Удължаването на имплицитното време на b-вълна по време на EIU е предотвратено с богатия на антоцианин екстракт от боровинка ( д ). * P ** P

Поддържане на нива на родопсин с богат на антоцианин екстракт от боровинки по време на EIU. Имуноблот анализ ( а, б ). Намаляването на съдържанието на родопсинов протеин по време на EIU е предотвратено с богатия на антоцианин екстракт от боровинка. * P ** P 14

Инхибиращ ефект на богатия на антоцианин екстракт от боровинки върху индуцираното от ретината активиране на STAT3 от EIU

В ретината намаляването на нивата на родопсин корелира с активирането на STAT3 с възпаление. 16, 17 Имуноблот анализът показва, че активираният STAT3 е регулиран по време на EIU и това увеличение е потиснато от богатия на антоцианин екстракт от боровинки (Фигура 3). По този начин активирането на STAT3 е в отрицателна корелация с нивата на родопсин.

Инхибиращ ефект на богатия на антоцианин екстракт от боровинки върху индуцираното от ретината активиране на STAT3 от EIU. Имуноблот анализ ( а, б ). Активираният STAT3 се оценява чрез измерване на pSTAT3. Увеличението на pSTAT3 по време на EIU е значително предотвратено чрез лечение с богат на антоцианин екстракт от боровинки. * P ** P

Потискане на провъзпалителния цитокин от богат на антоцианин екстракт от боровинка в ретината с помощта на EIU. PCR в реално време. Нивата на IL-6 тРНК бяха регулирани в ретината на модела EIU и потиснати с богат на антоцианин екстракт от боровинка. * P 23 Червената флуоресценция, представляваща ROS, беше увеличена в моделите ECLU в моделите GCL, INL и ONL; тази промяна обаче е предотвратена чрез лечение с богат на антоцианин екстракт от боровинки (Фигура 5).

Намаляване на оксидативния стрес чрез богат на антоцианин екстракт от боровинка в ретината с EIU. Представителни цифрови изображения на ретинални участъци, реагирали с DHE във всяка група ( а ). Интензитетът на флуоресценция беше измерен с ImageJ и осреднен ( б ). Увеличението на DHE флуоресценцията по време на EIU беше потиснато от богатия на антоцианин екстракт от боровинка. ** P 24, което може да е в посока, обратна на IL-6. Измерихме фосфорилиран р65, компонент на активиран NF-кВ, в ретината след EIU индукция чрез имуноблот анализ. Нивото на активиран NF-кВ се повишава в ретината по време на EIU; обаче беше значително потиснат от действието на екстракт от боровинки, богат на антоцианин (Фигура 6).

Както при хомозиготни, така и при хемизиготни нокаутиращи мишки с родопсин фоторецепторните клетки се губят в зряла възраст. Постоянният дефицит на родопсин поради продължително възпаление може впоследствие да причини дегенерация на фоторецепторни клетки. Следователно, богатият на антоцианин екстракт от боровинки може да играе роля за предотвратяване на тази късна невродегенерация. От практическа гледна точка възпалението в модела EIU не продължава по-дълго от 10 дни, 17, 28, което може да е причината да не се наблюдава апоптоза.

Намаляването на родопсина е свързано със STAT3 активиране и експресия на IL-6. Нашето предишно проучване показа, че намаляването на рододина, свързано със STAT3 по време на възпаление, се дължи на посттранскрипционен механизъм, който ние установихме за прекомерно разграждане от системите на убиквитин и протеазома. 17, 19 Активиран STAT3 индуцира E3-убикутин лигаза Ubr1, което увеличава разграждането на родопсин по време на възпаление, а ROS може да модифицира протеина на родопсин, който ускорява убиквитинацията и последващото разграждане. Също така забелязахме, че нивата на иРНК на родопсин не се променят при контролни условия или по време на възпаление, независимо от лечението с богат на антоцианин екстракт от боровинки (данните не са показани), в съответствие с участието на посттранскрипционна модификация. Следователно в настоящото проучване е вероятно същият механизъм на повишено разграждане да отчете намаленото ниво на родопсин. Богатият на антоцианин екстракт от боровинки потиска активирането на STAT3 и производството на ROS, което може да е предотвратило медиирано от UPS разграждане на родопсин.

Въпреки че STAT3 може да се активира от различни видове лиганди, това проучване показа, че един от кандидатите за неговото активиране във възпалителната ретина е IL-6. Всъщност се знае, че IL-6 се експресира в глиалните клетки 29 на Мюлер, което индуцира активирането на STAT3 надолу по веригата. Екстрактът от боровинки, богат на антоцианин, може да е действал, като е блокирал този порочен кръг от локално сигнализиране на IL-6-STAT3 в ретината. За разлика от това, нивото на TNF-α, друг провъзпалителен цитокин, не се е променило в това проучване (данните не са показани).

Оксидативният стрес е основен механизъм за локално възпаление и увреждане на тъканите по време на възпалителни процеси. 19 DHE се използва за откриване на супероксиден анион, произведен в различни биологични системи in vivo и in vitro. Наскоро беше установено, че DHE може да реагира и с други окислители като H 2 O 2 и ONOO. По този начин, червената флуоресценция на DHE по време на възпаление на ретината може да е показала няколко вида ROS, натрупани в ретината. Повечето от 15-те антоцианини, съдържащи се в боровинка 3, се доставят непокътнати до окото или ретината на живи животни. 31, 32 Тези предишни открития подкрепят идеята, че погълнатите антоцианини в това проучване са попаднали в ретината на EIU мишки, където директно са уловили ROS.

Активираният NF-кВ се увеличава в ретината, където ROS се натрупва поради EIU, и се потиска, след като ROS се намалява с богат на антоцианин екстракт от боровинки, което предполага, че ефектът на екстракта върху този редокс-чувствителен транскрипционен фактор е модулация на ROS като антиоксидант. Целевият ген NF-κB включва IL-6, което подкрепя идеята, че ефектът на богатия на антоцианин екстракт от боровинки върху активирането на STAT3 е потискане на индуцираната от ROS ос NF-κB-IL-6.

Интересното е, че богатият на антоцианин екстракт от боровинки инхибира активността на ангиотензин конвертиращия ензим (ACE) в съдовите ендотелни клетки чрез способността му да се свързва и хелатира Zn в активното място на ACE. 33 Ангиотензин II е силно силно регулиран по време на възпаление на ретината, а пътят на активиране на рецептора-STAT3 тип 1 на ангиотензин II също допринася за намаляване на родопсина по време на възпаление. По този начин, богатият на антоцианин екстракт от боровинки може да потисне намаляването на родопсин, като модифицира тази сигнализация за ангиотензин II. Известно е, че ангиотензин II стимулира локалната генна експресия на протеини, свързани с метаболизма на желязото 34, което може да увеличи регулирането на йонните транспортери и да улесни усвояването на желязото. Претоварването с желязо води до окислително увреждане 35, така че богатият на антоцианин екстракт от боровинки може да инхибира този път за защита на фоторецепторните клетки от оксидативен стрес. Затова богатият на антоцианин екстракт от боровинка може да инхибира множество пътища на ретината, за да защити зрителната функция.

През последните четири десетилетия основните и клинични проучвания на богатия на антоцианин екстракт от боровинка са засилени поради потенциални ползи за здравето. 8, 36 Въпреки това, подробният молекулярен (и) механизъм (и) на действие на този екстракт изисква допълнителни изследвания in vivo и in vitro. В това проучване демонстрирахме, че богатият на антоцианин екстракт от боровинки има противовъзпалително и антиоксидантно действие in vivo. Нашите открития могат да допринесат за бъдещото развитие на нови терапевтични подходи за защита на зрителната функция по време на възпаление на ретината.