абстрактно
Интересен резултат от метилирането на ДНК е транскрипционното заглушаване на цели хромозоми, трансгени, някои гени, регулирани от развитието, и гени на човешки заболявания (Knight et al., 1993; Li et al., 1993; Norris et al., 1994). Метилирането на остров CpG води до промяна в структурата на хроматина (Klein and Costa, 1997) и в някои случаи директно предотвратява свързването на положителни фактори с регулаторните елементи (Kass et al., 1997). Неотдавнашно проучване обаче показа, че само метилирането не може да заглуши един ген (Nan et al., 1997). В този процес са необходими някои метилирани ДНК свързващи протеини (MeCPs). Тъй като много напълно метилирани гени могат да бъдат транскрибирани с почти нормални скорости в отсъствието на метил-CpG свързващи протеини, е малко вероятно само CpG метилирането да направи тези места недостъпни за базалния транскрипционен апарат или да предотврати взаимодействието на транскрипционните фактори с промоторите.
Нашата лаборатория участва в идентифицирането на ключови промоторни елементи и трансактивационни фактори, които модулират транскрипцията на MT-I (Datta and Jacob, 1993, 1997; Aniskovitch and Jacob, 1997, 1998). По време на това проучване, ние забелязахме, че този ген не се индуцира в миши лимфосаркомни клетки (P1798), за разлика от нормалната индукция в майчините тимусни клетки. Това проучване е проведено, за да се определи потенциалната роля на метилирането на промотора в потискането на експресията на ген на MT-I в лимфосаркома клетки.
резултатът
Лимфосаркомните клетки експресират MT-I или MT-II гени в отговор на тежки метали само след лечение с 5-азацитидин.
Northern blot анализ на MT-1 иРНК в лимфосаркомни клетки преди и след лечение с 5-азацитидин и тежки метали. РНК, изолирани (30 μg) от контролни клетки и клетки, третирани с 5-AzaC (2.5 μM) в продължение на 72 часа, се разделят чрез електрофореза с формалдехид-агарозен гел (1.2%), прехвърлят се в найлонова мембрана и се омрежават от UV светлина. След това мембраната беше подложена на Northern blot анализ първо с произволно активирана, (32 Р-маркирана) мишка MT-I cDNA и след това с плъх GAPDH cDNA. Линии 1 до 3 показват нивата на РНК в нетретирани контролни клетки, клетки, третирани с 3 h ZnSO 4 (50 μM) и CdSO 4 (15 μM). Линии 4 до 6 показват нивата на РНК в нетретирани клетки, клетки, третирани в продължение на 3 часа с ZnSO 4 (100 μM) и CdSO 4 (30 μM) след третиране с 5-AzaC.
Изображение в пълен размер
Геномният анализ на следите показва, че нито един от транскрипционните активатори в лимфосаркомните клетки не може да се свърже с MT-I промотора in vivo
In vivo анализ на следите на MT-I промотора с 5 'праймери с долна верига преди и след третиране с 5-AzaC. Лимфосаркомните клетки преди и след третирането с 5-AzaC се инкубират с 0,1% диметил сулфат, както е описано в Материали и методи. Геномната ДНК се пречиства и пречиства с пиперидин. Използвайки LM-PCR, долната верига на MT-I проксималния промотор се амплифицира и разделя върху 6% гел за последователност. G-стълбата беше открита чрез авторадиография. N-гола G-стълба, C-контрол и обработка с Cd2 + -15 μM CdSO4. Регулаторните елементи MRE-b, MRE-c, MRE-d, MRE-e и MLTF/ARE са изброени до G-стълбата. Стрелките (←) показват C-остатъци, защитени от CdSO4, а звездичките (*) показват свръхчувствителни G-остатъци. Линии 1 до 3 представляват G-стълба в гола ДНК, контролни и третирани с CdSO4 клетки P1798, докато линиите 4 до 6 показват ленти от клетки, третирани с 5-AzaC за 72 часа. Подходящото разположение на долната стрелка на мястото на свързване MRE-c е трудно поради усмивката на гела, особено лента 6.
Изображение в пълен размер
Транскрипционните фактори, които регулират както базалната, така и индуцируема експресия на ген на МТ-1, са активни в лимфосаркомните клетки.
Тест за смяна на електрофоретична подвижност на MTF-1, Spl и MLTF/ARE в екстракт от лимфоцитни клетки S-100. а ) S-100 екстракти (10 μg протеин) от контролни клетки и третирани с ZnSO4 клетки (50 μM за 3 часа) бяха инкубирани с 32 P-маркиран MRE-d олиго при оптимални условия на свързване и ДНК-протеин. Комплексите се разделят върху полиакриламид (4% акриламид, акриламид: бисакриламид = 38, 7: 1, 3) гел с 0,25 х TBE като работещ буфер. Линии 1 и 5 представляват комплекси, образувани с екстракт от контролни клетки и третирани с цинк клетки. Линии 2 до 4 показват контролен екстракт, инкубиран със 100-кратен моларен излишък на немаркирани MRE-s, MRE-d и Sp1 олиго. ( б ДНК свързващата активност на MLTF/USF се измерва, като се използва 32-белязан MLTF/ARE олиго с екстракт, описан в ( а ) и комплексите се обработват върху 6% акриламиден гел с Tris (40 тМ) -глицин (267 тМ) като буфер. Линии 1 и 3 означават комплекси, образувани с екстракти от контролни клетки и клетки, изложени на цинк, а лента 3 - контролен екстракт, инкубиран със 100-кратен моларен излишък на E-box консенсус олиго.
Изображение в пълен размер
МТ-I промоторът не е метилиран в родителските клетки (миши тимус), но е метилиран при всички CpG последователности в миши лимфосаркомни клетки.
Картиране на сайта на рестрикционния ензим на PCR-амплифицирания миши MT-I промотор със специфичен за веригата праймер след бисулфитно преобразуване на хромозомна ДНК. Хромозомната ДНК се изолира от контролни клетки и 2,5 μM третирани с M-AzaC (72 часа) P1798 клетки, както и от миши тимус. След това тези проби бяха обработени с бисулфит и горната верига на MT-I промотора беше амплифицирана със специфични за веригата праймери чрез вложен PCR, както е описано в Материали и методи. След това усиленият продукт (1 μg) се усвоява с различни рестрикционни ензими, разделя се върху агарозен гел с ниска точка на топене с 2% и се оцветява с етидиев бромид. ( а Линии 2 до 4 представляват съответно Msp I, Apo I и Tsp509 I, разцепени контролна ДНК на лимфосарком. По същия начин, линии 6 до 8 показват усилена ДНК от третирани с 5-AzaC клетки, а линии 10 до 12 показват ДНК на тимуса, усвоена със същите рестрикционни ензими като контролата. Линии 1, 5 и 9 представляват PCR продукта от контролата, третиран с 5-AzaC лимфосарком и тимус, а лента M показва 100 bp ДНК стълба (New England Biolab). ( б ) Линии 1 до 4 представляват продукти, усвоени с амплифицирана ДНК от контролни клетки и третирани с 5-AzaC лимфоцитни клетки.
Изображение в пълен размер
( а ) Метилирани CpG динуклеотиди в миши MT-I промотор, идентифицирани чрез бисулфитно геномно секвениране в лимфосаркомни клетки. ( б ) PCR секвениране на бисулфит-конвертиран и амплифициран MT-I промотор на ДНК на горната верига от лимфосаркома клетки преди и след лечение с 5-AzaC и от тимус на мишка. PCR-амплифицираната горна верига на MT-I гена беше подложена на PCR секвениране, използвайки фемтомоларен комплект за секвениране на ДНК (Promega) със същите праймери, използвани във втория кръг на вложен PCR, (а) тимус, (b) контроли и (в) третирани с 5 -AzaC лимфосаркомни клетки
Изображение в пълен размер
Northern blot анализ на MT-I иРНК в третирани с 5-AzaC клетки и след това отглеждани в отсъствие на 5-AzaC. Клетките, третирани с 5-AzaC (+ 5-AzaC) и впоследствие отглеждани в среда без лекарства (± 5-AzaC), се третират с 50 μM ZnSO4 в продължение на 3 часа. Общо изолирана РНК (30 μg) от тези клетки беше подложена на Northern blot анализ с MT-I или GAPDH като сонда, както е описано на Фигура 1. Линии 1 и 2 представляват РНК от необработени или третирани с цинк + 5-AzaC клетки. линии 3 и 4 показват РНК от необработени и обработени с цинк ± 5-AzaC клетки
Изображение в пълен размер
дискусия
Показано е, че деметилиращият агент, 5-AzaC, дерепресира гена MT-I в две тимомни клетъчни линии, S-49 и W-7 (Compere и Palmiter, 1981). Тези проучвания обаче не изследват дали родителските клетки (тимус) са способни да индуцират МТ в отговор на тежки метали и дали реактивирането на MT-I промотора се дължи на директен ефект на 5-AzaC върху промотора или деметилиране и последващо активиране на ген-специфичен транскрипционен фактор. Ако MT-I промоторът е хиперметилиран, естеството на местата за метилиране в активно и неактивно състояние не е определено. Нито едно от тези проучвания не съобщава по-нататък дали заглушаването на МТ гени чрез промоторно метилиране е отличителен белег на получените от тимус тумори. Нашите резултати показват, че генът MT-I е безшумен в лимфосаркомните клетки, но не и в тимуса поради метилиране на CpG острови в промотора или в регион, близо до промотора. Също така наскоро забелязахме, че заглушаването на гена MT-I поради метилиране не се ограничава до тумори, получени от лимфоцити (K Ghoshal и ST Jacob, непубликувани данни). Тези наблюдения предполагат, че на някакъв етап от развитието на тумора, промоторът МТ-I става податлив на метилиране чрез ДНК метил трансфераза (ДНК-МТаза). Не е известно защо само някои гени, съдържащи CpG острови, са специфично метилирани в тумори.
Поразително наблюдение беше продължаването на реакцията на клетките P1798 на тежки метали, въпреки оттеглянето на 5-AzaC след първоначалното деметилиране и растежа на клетките в продължение на десет пъти удвояване. Тези данни подкрепят схващането, че de novo метилазата не е силно активна в тези лимфосаркомни клетки. Възможно е активността на de novo метилазата да бъде индуцирана преходно в началния етап на развитие на лимфосарком от тимус и метилиран ген MT-I. По-късно състоянието на метилиране на гена се поддържа от поддържаща метилаза, която използва хемиметилирана ДНК като субстрат (Szyf, 1996). Когато и двете вериги са деметилирани след третиране с 5-AzaC поддържащата метилаза не може да метилира тези CpG динуклеотиди. Наскоро беше показано, че множество форми на ДНК-МТаза се генерират в различни тъкани чрез алтернативно сплайсинг (Deng and Szyf, 1998). Въпреки че функциите на тези варианти все още не са известни, вероятно клетките P1798 експресират формата, която катализира поддържащото метилиране, но не тази, която показва активността на de novo метилаза.
$ config [ads_text16] не е намерен
Изглежда, че значително по-високо метилиране, което се случва в много туморни клетъчни линии, се дължи на по-висока активност на ДНК метил трансфераза (Szyf, 1996). Директната роля на DMA-MTase в размножаването на тумора е показана чрез свръхекспресия на cDNA за този протеин, което е довело до трансформация на клетките, чрез експресията на антисенс РНК го е предотвратила. Би било интересно да се сравнят активността и нивото на експресия на този ензим в тимуса и лимфосаркома. Също така измерихме нивото на експресия на няколко туморни супресорни гени, например pRb, p53, p16, които са безшумни при различни тумори чрез метилиране. Изненадващо и трите от тях се експресират в лимфосаркомните клетки (C Dong и ST Jacob, непубликувани данни). В този контекст може да се предположи, че друг тумор-супресорен ген, който може да бъде специфичен за Т-клетъчни тумори, се потиска в P1798 клетки чрез метилиране на неговия промотор. Алтернативно, металотионеинът сам по себе си или в съгласие с друг туморен супресор може да функционира като супресор на растежа в тези ракови клетки. Текат проучвания в тази насока. Независимо от това, това проучване категорично демонстрира, че хиперметилирането на MT-I промотора е единствено отговорно за неговата репресия в миши лимфосаркомни клетки.
Материали и методи
Клетъчна култура, лечение с 5-азацитидин и тежки метали
Миши лимфосарком P1798 клетки са подарък от д-р А. Е. Томпсън, Тексаски университет, Галвастон, САЩ. Тези клетки се отглеждат в среда RPMI 1640, съдържаща 25 m M HEPES (рН 7,2), 2 m M глутамин, 2% натриев бикарбонат, 0,2 μ M β-меркаптоетанол и 5% фетален говежди серум. Клетките с плътност 0,5 × 10 6 ml се третират с 2,5 цМ 5-азацитидин (Sigma) за 72 - 90 h, докато клетките се разделят поне веднъж. Контролните или третирани с 5-AzaC клетки с плътност 1 × 10 6/ml се третират с CdSO 4 (15 μ M) или ZnSO 4 (50 μ M) в продължение на 3 h.
Изолиране на обща РНК и анализ на Northern blot
Обща РНК се изолира от 107 клетки чрез фенолен метод с гуанидиний тиоцианат-киселина (Chomczynski and Sacci, 1987). Тридесет микрограма обща РНК се отделят чрез формалдехид-агарозен (1,2%) гел електрофореза и се прехвърлят в найлонова мембрана, която след това се хибридизира с произволно грундирани с мишка, а-32 P-dCTP-маркирани MT-I кДНК или глицералдехид-3- сонда фосфат дехидрогеназа (GAPDH) в буфер за бърза хибридизация (Amersham) следвайки протокола на производителя.
Анализ на електрофоретична промяна на мобилността (EMSA) на трансактиватори, които се свързват с миши MT-1 промотор
ДНК свързващите дейности на факторите се измерват в екстракта S-100, приготвен от лимфосаркомните клетки след публикуван протокол (Ghoshal и Jacob, 1996). За тази цел 10 μg от екстракта се инкубират с 0,1 - 0,5 ng от 32 Р-белязани дезоксиолигонуклеотиди в буфера, съдържащ 10 m M HEPES (pH 7,9), 60 m M KCl, 5 m M MgCl 2, 0,5 m M DTT, 10% глицерол и 1 μg поли (dI-dC). Олигонуклеотидите са маркирани чрез крайно пълнене с α- 32 P-dGTP и три други dNTPs с Klenow. Дейностите на MTF-1 и Sp1 бяха измерени с MRE-d олиго (Ghoshal et al., 1998Ghoshal et al., 1998). За конкурентна EMSA екстрактът беше предварително инкубиран със 100-кратен моларен излишък на немаркиран конкурент в продължение на 15 минути върху лед преди добавяне на белязания олиго. Реакционната смес се инкубира върху лед в продължение на 30 минути и ДНК-протеиновият комплекс се отделя чрез полиакриламидна (4% акриламидна) гел електрофореза. Последователностите на горната верига на използваните дезоксиолигонуклеотиди са следните: (1) MRE-d олиго (за Sp 1 и MTF-1) 5′-G ATCC AGGGAGCTCT GCACTCCG CCCGAAAAGTA; (2) MRE-s олиго (за MTF-1) 5′-GATCCAGGGAGCTCTGCACACGGCCCGAAAAAGTA; (3) MLTF/ARE (за MLTF) 5′-GATCCGCGGGGCGCGTGACTATGCGTGGGCTGGA; (4) MLTF (за MLTF) 5′-CACCCGCACGTGCCTACACC.
Бисулфитно геномно секвениране на MT-I промотор в лимфосаркомни клетки за определяне на метилираните цитозинови остатъци
За последователността на бисулфит на MT-I промотор в лимфосаркомни клетки или тимус на мишка, ние следвахме метода на Clark et al. (1994), с някои модификации, за да се улесни пълното превръщане на цитозините в урацили, като метил цитозините остават непроменени. ДНК се изолира от лимфосаркомни клетки и тимус на мишка и се денатурира (5 μg) с 0,3 М NaOH (прясно приготвен) при 37 ° С за 30 минути. Прясно приготвен разтвор на натриев метабисулфит (2,35 М), съдържащ хидрохинон (0,04 М), се добавя към денатурираната ДНК и се циклира двадесет пъти в термичен циклер при 50 ° С за 30 минути и 95 ° С за 2 минути. Обработената с бисулфит ДНК се обезсолява с помощта на Wizard DNA Clean Up kit (Promega), десулфонира се с 50 m M NaOH при 37 ° C в продължение на 30 минути, неутрализира се с натриев ацетат (рН 4,5) (0,2 М, крайна концентрация) и се пречиства с помощта на Wizard Комплект за почистване на ДНК. Аликвота от преобразуваната ДНК се използва за амплифициране на промотора МТ-I. Праймерите, използвани за амплифициране на горната верига на бисулфит-преобразувания MT-I ген са следните: За първи кръг на PCR (m = мишка): mMTI-S1: 5′-TAGAGTAGATGGGTTAAGGTGAGTG; mMTI-A1: 5′-ATCCCCACTTAATATTCTAAAAACC. За вложен PCR: mMTI-S2: 5′-AGGAGTAGAGAATAATGTTGAGATGAGT; mMTI-A2: 5′-CTTAAAAAACAACCTACCCTCTTTATAAT (температура на отгряване, 60 ° C).
За да се тества ефективността на бисулфитната реакция, амплифицираната ДНК (500 bp) първо се усвоява с рестрикционните ензими Apo I (G/C ↓ AATT ↑ A/T) и Tsp509 I (↓ AATT ↑), които могат да разцепят само преобразуваното, но не и непокритата ДНК. Рестрикционните места за тези два ензима се генерират само когато С остатъците се преобразуват в Т остатъци. Завършването на превръщането на бисулфит се потвърждава от пълно усвояване на амплифицираната ДНК с Apo I или Tsp509 I. След това секвенираме PCR продуктите от лимфосаркомни клетки и тимус чрез fmol система за секвениране (Promega) с вложени PCR праймери, както и с вътрешен праймер 5 ' -TTGGGGAAAGTATTATAGGGATATGATG за горната нишка. В третираната с бисулфит ДНК само метилирани цитозини ще бъдат секвенирани като Cs и преобразуваните неметилирани C остатъци ще бъдат секвенирани като Ts. Бисулфитното геномно секвениране също се извършва с хромозомна ДНК от клетките, третирани с 2,5 μ M 5-AzaC в продължение на 72 h, които експресират MT-1 в отговор на тежки метали.
In vivo анализ на геномния отпечатък на промоторния регион на миши MT-I ген на лимфосаркомни клетки преди и след деметилиране с 5-AzaC
In vivo метилирането на клетъчната ДНК и екстракцията на ДНК са описани от Mueller and Wold (1989). ДНК последователността, която представлява интерес, се усилва чрез лигирана-медиирана PCR (LM-PCR), съгласно процедурата на Meuller и Wold, модифицирана от Ping et al. (1996). Накратко, процедурата включва излагане на лимфосаркомните клетки в културалната среда (RPMI) на диметилсулфат (1 μl/ml) в продължение на 2 минути при стайна температура, последвано от пречистване на геномна ДНК. След това метилираната ДНК се разцепва при позиции на метилгуанин с пиперидин (10%) при 90 ° С за 30 минути. След това пречистената, разцепена ДНК (2 μg) се подлага на LM-PCR, за да се анализира отпечатъкът при MRE последователности и MLTF/ARE с специфични за мишки MT-I промотор праймери, както е описано по-рано (Mueller and Wold, 1989). Праймерите, използвани за LM-PCR на долната верига, са следните: (1) 5′-GAGTTCTCGTAAACTCCAGAGCAGC; (2) 5′-CAGAGCAGCGATAGGCCGTAATATC; (3) 5′-GATAGGCCGTAATATCGGGGAAAGCAC.
Благодаря
Авторите са благодарни на Обри Томпсън и Ричард Палмитър за предоставянето на миши лимфосарком P1798 клетки и миши миниген MT-I, съответно. Тази работа беше подкрепена отчасти от USPHS грант CA61321 за ST Jacob и ACS институционален грант за K Ghoshal.