абстрактно

При еукариотите много гени се подлагат на алтернативно сплайсинг и кодират множество изоформи, водещи до експресията на сродни протеини с различни биохимични и биологични свойства (Andreadis et al., 1987). IG20 (Insulinoma - Glucagonoma) е един такъв ген, който може да кодира най-малко четири различни варианта на снаждане (SV), а именно IG20pa (т.е. IG20 проапоптотичен), MADD/DENN, IG20-SV2 и DENN-SV (Goto et al., 1992, Чоу и Лий, 1996, 1998; Cunningham, 1996; Schievella et al., 1997; Al-Zoubi et al., 2001). Тези четири IG20 -SV се различават чрез диференциално сплайсинг на екзони 13L и 16. По отношение на IG20pa, MADD, IG20-SV2 и DENN-SV не експресират екзон 16 или 13L или и двете (Al-Zoubi et al., 2001).

Генът IG20 играе важна роля в пролиферацията, апоптозата и оцеляването на раковите клетки (Chow and Lee, 1996, 1998; Schievella et al., 1997; Brinkman et al., 1999; Murakami-Mori et al., 1999; Telliez et al., 2000, Al-Zoubi et al., 2001; Lim and Chow, 2002; Efimova et al., 2003, 2004; Lim et al., 2004; Ramaswamy et al., 2004). В допълнение, той играе важна роля в невротрансмисията (Zhang et al., 1998; Tanaka et al., 2001; Yamaguchi et al., 2002), невродегенерацията (Del Villar and Miller, 2004) и обмена на гуанинови нуклеотиди (Wada et al. . 1997, Браун и Хау, 1998; Ивасаки и Тойонага, 2000; Левивие и др., 2001). Тези разнопосочни функции са най-вероятно медиирани от алтернативно снаждане (Chow et al., 1998; Al-Zoubi et al., 2001; Efimova et al., 2004).

Нивата на експресия на гена IG20 са по-високи в раковите клетки и тъкани в сравнение с техните нормални аналози. Въпреки че MADD и DENN-SV са конститутивно изразени (DENN-SV е свръхекспресиран в сравнение с други SV при рак), експресията на IG20pa и IG20-SV2 е регулирана, така че те могат или не могат да бъдат експресирани в определени клетки. Това показва, че IG20pa и IG20-SV2 не са необходими за оцеляване на клетките (Efimova et al., 2004).

Преди това сме провеждали проучвания за подобряване на функцията чрез експресията на отделни IG20-SV в HeLa клетки и са показали, че вариантите MADD и IG20-SV2 имат малък или никакъв ефект върху клетъчната пролиферация и индуцирана апоптоза. Докато IG20pa повишава чувствителността както към външни, така и към вътрешни апоптотични стимули и потиска клетъчната пролиферация, DENN-SV осигурява резистентност към индуцирана апоптоза и повишена клетъчна пролиферация. По този начин IG20pa и DENN-SV действаха като "туморен супресор" и "онкоген" (Efimova et al., 2004).

Нокдаунът на всички ендогенни IG20-SV, използвайки антисенс олигонуклеотиди, доведе до спонтанна апоптоза на раковите клетки in vitro и in vivo (Lim and Chow, 2002; Lim et al., 2004). По този начин, контрастните ефекти на IG20-SV, споменати по-горе, могат да бъдат изяснени само чрез изключване на отделните IG20-SV и определяне на последващите ефекти. Това поставя няколко предизвикателства, тъй като IG20-SV се различава само по диференциалната експресия на екзони 13L (130 bp) и 16 (60 bp) (Al-Zoubi et al., 2001). Въпреки това, използвайки малки РНК на фиби (shRNAs), които конкретно са насочени към екзони 13L, 15 и 16, успяхме селективно да утаим или всички, или различни комбинации от IG20-SV в клетъчни линии HeLa и PA-1 и да определим тяхната роля за оцеляването клетки. Нашите резултати показват, че MADD сам по себе си е необходим и достатъчен за оцеляването на тези ракови клетки.

резултатът

Малките инхибиторни РНК могат селективно да намалят експресията на екзогенни IG20-SV

За да определим IG20-SV, които допринасят за апоптозата и клетъчната пролиферация, използвахме малки инхибиторни РНК (siRNAs), за да намалим селективно IG20-SV (Таблица 1) (McManus and Sharp, 2002; Cullen, 2004; Hall, 2004). SiRNAs са клонирани в pSUPER вектор (Brummelkamp et al., 2002), за да се позволи експресия на shRNA. 293T клетки бяха трансфектирани или с YFP-IG20pa, YFP-MADD или YFP-DENN-SV, заедно с различни pSUPER вектори, експресиращи shRNA при 1: 1, 1: 3 и 1: 7. Намаляването на експресията на YFP показа нокдаун на съответния протеин израз. Няколко shRNAs бяха скринирани и резултатите за най-ефективните са показани на фигура 1а. 13L-shRNA, насочена към екзон 13L, понижена от IG20pa/MADD, оставяйки изражението на DENN-SV непроменено. За разлика от това, 16E-shRNA е насочена към екзон 16, понижен от IG20pa, но не и MADD/DENN-SV. Средно-shRNA, насочена към екзон 15, понижава всички тествани IG20-SV. Векторът сам или контролната shRNA имат малък или никакъв ефект върху експресията на IG20-SV.

Маса в пълен размер

madd

Проверка на shRNA за нокдаун IG20. а ) Намалена експресия на екзогенни IG20-SV. 293T клетки бяха поставени в 12-ямкови плаки и ко-трансфектирани с посочените IG20-SV-YFP и pSUPER-shRNA конструкции. Експресията на YFP се изразява като средната интензивност на флуоресценция. Представените данни (средно ± SD на три повторения) са представителни за три независими експеримента, всеки със стойности на Р

Понижаване на модулацията на ендогенния IG20-SV в HeLa клетки. Един микрограм от обща РНК, получена от HeLa клетки 72 часа след трансдукцията, се използва за верижна реакция с обратна транскрипция-полимераза. Продуктите се разделят на 2% агарозен гел. ( а ) Усилване и на четирите IG20-SV, използвайки праймери F2-B2. ( б ) Количествено определяне на относителната интензивност на лентата от панела и с помощта на Alpha Imager (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). ( ° С ) Усилване на IG20pa и MADD с помощта на праймери 13L-напред и B2-обратен. д ) Количествено определяне на относителната интензивност на лентата от панел c.

Изображение в пълен размер

Понижаването на модулацията на IG20-SV в HeLa клетки води до спонтанна апоптоза

Спонтанната клетъчна смърт се определя чрез ядрена кондензация (Hoechst 33342) (Фигура 3а и b) и загуба на митохондриален мембранен потенциал (оцветяване на тетраметилродаминов естер [TMRM]) (Фигура 3в и d). Понижаването на модулацията на всички IG20-SV с Mid-shRNA води до значителна спонтанна апоптоза. Въпреки че понижаването на модулацията на IG20pa/IG20-SV2 няма ефект, премахването на MADD/IG20pa води до повишена спонтанна апоптоза. За да определим дали основната причина за спонтанна апоптоза е подобна на тази, наблюдавана по време на апоптоза, индуцирана или от външния (каспаза-8), или от вътрешния път (каспаза-9), определихме процента на клетки, експресиращи активни каспази-8 и -9. чрез поточна цитометрия.

Ефект на IG20-SV понижаваща модулация в HeLa клетки. ( а ) Hoechst оцветяване - 72 h след трансдукция, HeLa клетки се събират и оцветяват с 5 ug/ml Hoechst и се подлагат на флуоресцентен активиран анализ на сортиране на клетки (FACS). Процентите на силно положителни клетки (апоптотични клетки) са показани на хистограмите. ( б ) Обобщение на резултатите, показващи процента на клетките с повишена ядрена кондензация, измерен чрез оцветяване на Hoechst от три независими експеримента. Стойността на P беше

Активиране на каспаза след понижаване на IG20-SV. ( а ) Общо активиране на каспаза - HeLa клетки се събират 60 часа след трансдукцията и се оцветяват за всички активирани каспази, използвайки Red-z-VAD-FMK; ( б ) за каспаза-8 с Red-IETD-FMK; а ( ° С ) за каспаза-9 с Red-LEHD-FMK и анализиран от FACS. Показано е процентното активиране на каспаза в GFP-положителни клетки (средно ± SD на три повторения).

Изображение в пълен размер

Понижаването на модулацията на IG20-SV няма видим ефект върху пролиферацията на HeLa клетки

За да се оценят ефектите върху клетъчния растеж и пролиферация, бяха преброени различни жизнеспособни клетки, експресиращи shRNA. В сравнение с контролите се наблюдава значително намаляване на броя на жизнеспособните клетки, експресиращи Mid- и 13L-shRNA (Фигура 5а). Недостатъчната разлика в разреждането на CFSE (SNARF-1 карбоксилна киселина, ацетат, сукцинимидилов естер) във времето между контролните клетки, третирани с Mid- и 13L-shRNA клетки, предполага, че разликите в броя на клетките не се дължат на намалена пролиферация (Фигура 5b). чрез посяване на един и същ брой HeLa клетки, експресиращи различни shRNA и определяне на броя и размера на колониите след 12 дни. Въпреки че значително по-малко колонии се образуват от клетки, експресиращи Mid и 13L-shRNA (панели d, e), размерът на колониите е сравним с размера на контролните групи. Освен това, третирани с shRNA клетки не показват значителни разлики в прогресията на клетъчния цикъл (не е показано). Взети заедно, тези резултати показват, че аблацията на MADD води предимно до спонтанна апоптоза.

Ефект на IG20 понижаваща модулация върху пролиферацията на Hela клетки. а ) Клетъчен растеж. Двадесет и четири часа след трансдукцията, HeLa клетките се посяват, както е описано в Материали и методи. След това клетките бяха събрани и жизнеспособните клетки (отрицателни трипанови сини клетки) бяха преброени в посочените дни. Данните са средни ± SD на три екземпляра. ( б ) Клетъчно разпространение. Двадесет и четири часа след трансдукцията, HeLa клетките бяха оцветени с CFSE-червено (SNARF-1-карбоксилна киселина, ацетат, сукцинимидилов естер), събрани в посочените дни и оценени за CFSE разреждане чрез флуоресцентно активирано сортиране на клетки. Числата на хистограмите показват средния геометричен интензитет на CFSE оцветяване в трансдуцираните клетки. ( ° С - ж ) Клетъчно оцеляване. Показва оцветяване на клетки, оцелели 12 дни след понижаване на IG20 -SV в кристално лилаво.

Изображение в пълен размер

Намаляването на MADD в клетките на яйчниковия карцином PA-1 води до спонтанна апоптоза

В HeLa клетките бихме могли да понижим модулацията и на четирите, или комбинация от IG20pa/MADD или IG20pa/IG20-SV2. За да се демонстрира допълнително, че MADD е необходим за оцеляване на клетките, ние използвахме клетки PA-1 на яйчниковия карцином, които по същество експресират само MADD и DENN-SV (Efimova et al., 2004), като по този начин позволяват изключителна понижаване на MADD от 13L-shRNA. Докато Mid-shRNA модулиран надолу MADD/DENN-SV, 13L-shRNA само премахва MADD експресията (Фигура 6а и b). Спонтанна апоптоза е очевидна при приблизително 50% от клетките 72 часа след трансдукция с 13L-shRNA (Фигура 6в и d).

Ефект на IG20 понижаваща модулация в клетки PA-1. ( а ) Понижаване на модулацията на ендогенния IG20 в клетки PA-1. Обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция на IG20-SVs от PA-1 клетки, 72 h след трансдукция, като се използват праймери F2-B2. ( б ) Усилване на IG20pa и MADD само с помощта на праймери 13L-F и B2. ° С ) Ядрена кондензация. Седемдесет и два часа след трансдукция, PA-1 клетките се оцветяват с багрило Hoechst и се анализират чрез флуоресцентно сортирано клетъчно сортиране (FACS). Процентите на апоптотичните клетки са показани на хистограмите. ( д ) Митохондриална деполяризация. Седемдесет и два часа след трансдукцията, PA-1 клетките се оцветяват с TMRM и се анализират чрез FACS. Представените данни са представителни за три различни експеримента.

Изображение в пълен размер

Определихме способността на подобно третирани PA-1 клетки да се размножават. Култивират се равен брой PA-1 клетки, получаващи различни лечения (24 часа след трансдукцията) и броят на жизнеспособните клетки се определя в различни моменти от времето (Фигура 7а). Въпреки че загубата на MADD доведе до значително намаляване на броя на клетките, подобно на HeLa клетките, това няма ефект върху разреждането на CFSE или размера на колонията (Фигура 7b-g).

Ефект на IG20 понижаваща модулация върху пролиферацията на PA-1:( а ) клетъчен растеж, ( б ) разпространение, ( ° С ) оцеляване на клетките. Експериментите са проведени, както е описано по-горе с HeLa клетки (виж Фигура 5 легенда). Представените данни са представителни за три различни експеримента.

Изображение в пълен размер

MADD, а не DENN-SV, може да предотврати спонтанна апоптоза

Нокдаун само на MADD в клетки PA-1 доведе до спонтанна апоптоза. За да се определи дали експресията само на DENN-SV ще спаси клетките от повишена спонтанна апоптоза, те ко-експресират 13L и 16E shRNA в HeLa клетки и откриват повишена спонтанна апоптоза. Това допълнително потвърди критичното изискване на MADD, а не DENN-SV, за оцеляване на клетките (Фигура 8).

Понижаването на модулацията на MADD причинява спонтанна апоптоза. HeLa клетките бяха заразени с посочените лентивируси, експресиращи хънт. Седемдесет и два часа след трансдукция ( а ), извършена е верижна реакция с обратна транскрипция-полимераза, както е описано по-горе, и продуктите са разделени на 2% агарозен гел. ( б ) Извършено е оцветяване по Hoechst за определяне на спонтанна апоптоза.

Изображение в пълен размер

За да демонстрираме нагледно основната роля на MADD в оцеляването на клетките, генерирахме клетки HeLa, стабилно експресиращи MADD-YFP-Mut и DENN-SV-YFP-Mut (Фигура 1b). Както е показано на Фигура 9а, 72 часа след трансдукция, Mid-shRNA не е в състояние да понижи модулацията нито на MADD-YFP-Mut, нито на DENN-SV-YFP-Mut; докато 13L-shRNA може да понижава модулирането както на ендогенни, така и на MADD-YFP-Mut. Интересното е, че експресията на MADD-YFP-Mut, а не на DENN-SV-YFP-Mut, беше достатъчна, за да предотврати появата на спонтанна апоптоза в третирани със Mid-shRNA Hela клетки (Фигура 9b). Подобни резултати са получени в PA-1 клетки (не са показани). Тези резултати ясно показват, че само MADD може да попречи на раковите клетки да претърпят спонтанна апоптоза.

MADD, а не DENN-SV, може да предотврати спонтанна апоптоза. ( а ) IG20-SV обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция от клетки, трайно трансфектирани или с контролния вектор, MADD-YFP-Mut или DENN-SV-YFP-Mut и заразени с вируси, експресиращи shRNA за 72 часа. б ) Ядрена кондензация. HeLa клетките се оцветяват с Hoechst за определяне на спонтанна апоптоза. Представените данни са представителни за три различни експеримента (P