невирусен

  • елементи
  • методи
  • Разтвор на микромехурчета/плазмиди и вирусни вектори
  • Катетеризация на животни и слюнчените жлези
  • Показване на Luc in vivo
  • Количествено определяне на генния трансфер и статистически анализ
  • хистология
  • Автори
  • Търсене на MJ Passineau в:
  • Търсене на L Zourelias в:
  • Търсене на L Machen в:
  • Търсене на PC Edwards в:
  • Търсене на RL Benza в:

елементи

  • Доставка на ген
  • ултразвук
  • Оригиналната статия е публикувана на 27 май 2010 г.

Корекция: Генна терапия (2010) 17, 1318 - 1324; doi: 10, 1038/gt.2010, 86

След публикуването на тази статия авторите установиха, че има няколко случая, когато микрограмите са публикувани в милиграми в раздела Методи. Правилната част на метода е дадена по-долу.

методи

Разтвор на микромехурчета/плазмиди и вирусни вектори

Окончателните микромехурчета са закупени като инжекционна суспензия от 2 ml и са активирани с устройство Vialmix в съответствие с инструкциите на производителя (Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA, USA). Микромехурчетата бяха използвани за експерименти в рамките на 30 минути след тяхното активиране. Общо 50 μg pCMV-GL3 (плазмид, експресиращ GL3 Luc, конструиран чрез вмъкване на промотора на цитомегаловирус (CMV) в pGL3-основното място за многократно клониране; Promega, Madison, WI, USA) се смесва с 50 μg. разтвор на микромехурчета, или 100 или 15% I/O разтвор с фосфатно буфериран физиологичен разтвор.

За медииран от Ad трансфер на ген е създаден нереплициращ се Ad Serotype 5 вектор, базиран на системата Stratagene AdEasy чрез клониране на GL3 последователността (от Promega pGL3 Basic вектора) в множество места за клониране на pShuttle-CMV вектора (Stratagene, La Jolla, Калифорния, САЩ). Транспортният вектор се рекомбинира в гръбначния стълб на AdEase и полученият вектор, Ad-CMVGL3, се усилва и пречиства до титър от 3,5 до 1012 vp ml-1. Ad векторите се доставят в 50 μg фосфатно буфериран физиологичен разтвор.

Катетеризация на животни и слюнчените жлези

C57BL/6 мишки са получени от Jackson Labs (Bar Harbor, ME, USA) и се поддържат в условия, свободни от патогени във вивариума на изследователския институт Allegheny-Singer, с достъп до стандартна храна и вода ad libitum. Експериментите с животни и протоколите са прегледани и одобрени от Институционалния комитет по грижата за животните и тяхното използване от Изследователския институт Allegheny-Singer. Трансферът на гени към слюнчените жлези се осъществява, както вече беше описано от Вутетакис и неговите колеги. 4 Накратко, животното беше обезболено и поставено в стереотаксична рамка, за да държи устата отворена. Писалката беше прибрана и тънък пластмасов катетър беше поставен в отвора на субмандибуларния канал от едната страна, преместван от

1 см и се държи на място с лепило. Общо 50 μg разтвор на носител, носещ вектор за генен трансфер (вирус или плазмид/микромехурчета), се влива в канала от едната страна с катетър и буталото се оставя на място за 10 минути, за да може векторът да влезе в контакт с слюнка епители. клетки. След това катетърът беше изваден и животното се върна в клетката си, за да се събуди нормално.

В експериментите за трансфер на ултразвуков ген, кожата непосредствено над слюнчената жлеза се третира с депилаторен агент, използва се търговски ултразвуков гел и ултразвуков излъчвател (SoniGene, VisualSoincs Inc., Торонто, Онтарио, Канада) е в пряк контакт с кожа на припокриването. След вливане на плазмидния разтвор от микромехурчетата бяха приложени импулси от 4 х 30 s при следните параметри: 1 MHz, 50% работен цикъл и 2 W cm-2, с 10 s между импулсите. След четири импулса облъчвателят беше изтеглен и животното беше оставено да си почине в продължение на 10 минути, преди да извади катетъра.

Luc изображения in vivo

Мишките се инжектират интрамускулно с 1 ml на g телесно тегло кетамин (20 g ml-1)/ксилазин (100 mg ml-1), смесени в съотношение 3: 2. След анестезия, мишката се инжектира интраперитонеално с D-луциферин субстрат (XenoLight D-калиев луциферин, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) в доза (100 μl на 10 g телесно тегло, 15 mg ml-1 запас). След това мишките бяха поставени в херметична камера и бяха генерирани изображения за 1 минута на експозиция с помощта на криогенно охладена камера за свързване IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences), за да се определят количеството на спонтанно излъчваните от животното фотони. Изображенията бяха псевдоцветни с помощта на софтуера Xenogen (Caliper Life Sciences) и се припокриваха в черно-бяла снимка на животното, генерирана от осветлението в шкафа. Визуалният изход представлява броя на фотоните, излъчени за s на cm 2 като псевдоцветно изображение, в което максимумът е червен, а минимумът е лилав.

Количествено определяне на генния трансфер и статистически анализ

Изображенията, получени от изображения in vivo, бяха анализирани с помощта на софтуера Living Image (Caliper Life Sciences). Фотоните, излъчени от слюнчената жлеза, се определят количествено чрез определяне на NI над анатомичното положение на слюнчената жлеза. В повечето случаи тази възвръщаемост на инвестицията се генерира автоматично с помощта на софтуера "Автоматична контурна възвръщаемост на инвестицията" и общият поток (фотони в секунда) се измерва в областта на възвръщаемостта на инвестицията. В случаите, когато софтуерът не може да генерира автоматична възвръщаемост на инвестицията или ако липсва разпознаваем сигнал, над анатомичното положение на слюнчената жлеза се поставя кръг с диаметър приблизително 0,75 cm и се измерва общият поток. Постоянно откривахме, че фоновата стойност 3 × 104 е фоновата стойност в тази система. Стойностите обаче бяха отчетени в таблиците като общ поток, без корекция на фона.

хистология

За да разследваме възможни разлики в сиалоаденита, причинени от двата остри метода за доставка на ген, извършихме трансфер на ген на втора кохорта животни, използвайки методи, идентични на описаните по-горе, с изключение на това, че половината от животните в тази кохорта бяха жени, като половете бяха равномерно разпределени разделяне между рекламни групи и UAGT групи. Животните бяха умъртвени след 7 дни и слюнчените жлези бяха отстранени, фиксирани, вградени в парафин, нарязани на микротоми и оцветени с хематоксилин и еозин. Ослепен орален патолог (PCE) изследва диапозитивите и класифицира степента на сиалоаденит по скала от 1 (норма) до 4 (тежка, с пълно унищожаване на ацинарните клетки) въз основа на модификация на Isacsson et al. 24

За да изследваме пространственото разпределение на плазмидни/микро-мехурчести вектори и получената експресия на трансген, ние предоставихме pCMV-GFP, GFP-експресиращ плазмид, по същия начин, както е описано по-горе, използвайки 15% разтвор на носител с микромехурчета. Непосредствено преди инфузията на сместа от плазмид/микромехурчета и след това са получени ултразвукови изображения на слюнчените жлези на VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics Inc., Торонто, Онтарио, Канада) със сканираща глава RMV-704, работеща в режим B при 40 MHz. След 7 дни животните бяха умъртвени и слюнчените жлези бяха отстранени, фиксирани и вградени в парафин. Разрезите бяха тествани с конюгирани с флуоресцеин изотиоцианат анти-GFP поликлонални антитела (Abcam, Cambridge, MA, USA).

Авторите биха искали да се извинят за тази грешка.