засилва

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Там индуцира намаляване на мастната маса при мишки
  • Там той насърчава апоптозата и автофагията в мастната тъкан
  • Там той подкрепи производството на ROS
  • Антиоксидантът премахва индуцираната от Tam ROS, апоптоза и автофагия
  • Антиоксидантът обърна индуцираното от Tam намаляване на клетъчната плътност и популацията на адипоцитите
  • Антиоксидантът обръща индуцирана от Tam понижаваща регулация на активирания от пероксизома пролифератор гама рецептор (PPARy)
  • дискусия
  • Материали и методи
  • материали
  • мишки
  • Клетъчна култура и лечение
  • ROS измерване
  • Уестърн блотинг
  • Статистически анализи
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнително изображение S1
  • Допълнително изображение S2
  • Word документи
  • Допълнителни легенди за изображения
  • Терминологичен речник

елементи

  • биохимия
  • Медикаментозна терапия
  • Затлъстяване

абстрактно

За да се разбере молекулярният механизъм на развитието на затлъстяването, са разработени различни модели на гризачи, които изследват печалбата или загубата на функция на различни гени. 6, 7 За тази цел специфичната за мястото рекомбинантна система Cre/lox е универсална за генериране на условни миши мутанти, контролиране на генната експресия и активност в прицелните тъкани. 8, 9 Тамоксифен (Tam) се използва главно за активиране на Cre рекомбинази пространствено in vivo чрез интраперитонеално (IP) или подкожно приложение. 10, 11, 12 Инжекционен Tam в доза от 1 - 8 mg/kg телесно тегло в продължение на 5 последователни дни изтрива целевите гени, създавайки цялостна система за изследване на функционални гени при затлъстяване. 8, 9, 10, 11, 12

резултатът

Там индуцира намаляване на мастната маса при мишки

За да тестваме ефекта на Tam върху мастната маса, извършихме 5-дневно IP приложение на Tam (1 mg/20 g телесно тегло) върху флокирани O1 вилични мишки (Fox01) без Cre рекомбиназни мишки (f-Fox01), 15, 16, 17 след стандартния протокол, установен по-рано. 12 Две седмици след приложение Там телесните мазнини при мишки f-Fox01 са намалели с 34% (Р 15, 16 и установихме, че мастната маса също е намаляла значително (26%, Р

Налице е намаление на мастната маса при f-Fox01 мишки. а ) Кинетика на регулирането на мастната маса след 5 дни прием Tam. ( б ) Измерване на телесно тегло преди лечение с Tam (pre-Tam), 2 седмици (2 седмици) и 6 седмици (6 седмици) след инжектиране на Tam. ( ° С ) Тегло на епидидималната мастна тъкан (eWAT) на седмица 2 при мишки, лекувани с Tam. ( д ) eWAT тегло на седмица 6 при мишки, лекувани с Tam. п = 4-6; * P 18, 19, 20, 21, 22, 23 За да изследваме дали Tam има ефекти върху апоптозата и автофагията, използвахме eWAT на седмици 2 и 6 след приложението на Tam и анализирахме медиатори на апоптоза и автофаги - активирана или разцепена каспаза 3 (Cas3 ). (c)) и конюгат 1-фосфатидилетаноламин 3A/1B с лека верига (LC3). 24, 25 Както е показано на фигури 2а и b, лечението с Tam повишава нивата на Cas3 (c) 6-8 пъти (P

Там той насърчава ROS и оксидативен стрес. ( а ) Уестърн блотинг на HO1 в мастната тъкан на мишка на седмици 2 и 6 след прилагане на Tam с GAPDH (глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа), изследван като контролен товар. ( б ) денситометричен анализ на изображения на западни предавания с помощта на софтуера NIH ImageJ; n = 6–8. ° С ) Измерване на ROS в мастната тъкан на 2 седмици след приложението на Tam (n = 3-4). д ) Измерване на ROS в мастната тъкан на 6-та седмица след приложението на Tam (n = 3-4). ** P 32, 33 Както се наблюдава в мастната тъкан, Tam индуцира значително регулиране на HO1 в адипоцитите на 3T3L1 и ефектът зависи от дозата в тестовия диапазон 0 - 128 μM (допълнителна фигура S2). Там също се насърчава производството на ROS 2, 5 пъти (P

Антиоксидантът NAC отслаби нивото на ROS и обърна ефектите там. а ) Измерване на ROS в адипоцити 3T3L1. ( б а ° С ) Western blot анализ ( б ) HO, Cas3 (c) и LC3 в 3T3L1 адипоцити след 48 часа лечение с Tam (128 μM) или Tam (128 μM) плюс NAC (1 mM), с денситометричен анализ ( ° С ) Западни изображения за предаване с помощта на софтуера NIH ImageJ; GAPDH (глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа) беше тестван като контрол на натоварването. п = 3-5; * P 2 попитахме дали лечението с Tam влияе върху клетъчната плътност. В сравнение с обработените с носител адипоцити, обработените с Tam клетки показват значително намаляване на клетъчната плътност (24%, P 34, 35, 36. Независимо от това, добавянето на RAC-чистач NAC значително възстановява плътността на клетките и зрялата популация на адипоцитите (Фигури 5в и д).

Антиоксидантът NAC отслабва ефекта върху клетъчната плътност и зрялата популация на адипоцитите. а - ° С ) микроскопско изобразяване на третирани с носител адипоцити 3T3L1 ( а ), 128 μM Tam ( б ) и Tam (128 μM) плюс NAC (1 mM) ( ° С ). Микроскопът е настроен на х 100. ( д а д ) Измерване на клетъчна плътност и популация на зрели адипоцити с помощта на софтуера NIH ImageJ; n = 6–8. * P 34, 35, 37 Наблюдението на намалена популация на зрели адипоцити след лечение с Tam ни накара да анализираме ефекта на Tam върху PPARγ. Както е показано на Фигура 6а, нивата на PPAR γ протеин са намалени със 74% в третирани с Tam адипоцити (P

Механизмът, чрез който Там намалява мастната маса, включва няколко клетъчни събития. Лечение Има повишена апоптоза и автофагия, процеси, които намаляват броя на адипоцитите и участват в регулирането на мазнините. 2, 18, 19, 20, 21, 22, 23 След лечение там, клетъчната плътност и популацията на зрели адипоцити всъщност намаляват. Там той също така насърчава дедиференциацията на адипоцитите и производството на ROS, докато нормализирането на нивата на ROS значително отслабва индуцираната от Tam дедиференциация на адипоцитите, апоптозата и автофагията, като същевременно възстановява старата популация на адипоцитите и мастната маса. Заедно нашите данни категорично предполагат, че краткосрочното (5-дневно) лечение с Tam намалява мастната маса чрез увеличаване на производството на ROS.

Там е доказано, че индуцира ROS и оксидативен стрес в клетки на рак на гърдата, хепатобластома клетки, ретинални клетки и тромбоцити чрез активиране на NAD (P) H оксидаза, ензим, който също насърчава производството на ROS в макрофаги. 32, 42, 43, 44, 45, 46 Ефектът за повишаване на ROS там беше разширен и допълнително потвърден от нашето проучване върху адипоцити и мастна тъкан. Важно е, че открихме, че повишената ROS води до понижаване на регулацията на PPARγ и дедиференцирането на адипоцитите, подкрепяйки схващането, че зрелите адипоцити се подлагат на дедиференциация при стресови условия. 34, 35 Доказано е, че провъзпалителните адипоцитокини (напр. TNFα) могат да насърчат дедиференцирането на адипоцитите чрез понижаване на регулирането на PPARy. 34, 35 Тъй като повишаването на нивата на ROS или оксидативният стрес увеличава производството на TNFα, 47 Там той може да насърчи дедиференциация на адипоцитите чрез активиране на ROS-TNF α - PPAR γ оста. За тази цел инфилтрацията на макрофаги в мастната тъкан може да играе роля, тъй като е доказано, че тези фагоцити индуцират производството на ROS и TNFα, а също така реагират чувствително на ROS и TNFα-медиирани сигнални каскади. 46, 48

Материали и методи

материали

Средата на Dulbecco's Eagle (DMEM) беше от Corning Inc. (Манасас, Вирджиния, САЩ). Фетален говежди серум (FBS) е от GeneMate (Kaysville, UT, USA). Дексаметазон, 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), розиглитазон и Tam са закупени от Cayman chemical (Ann Arbor, MI, USA). Пеницилин/стрептомицин (P/S) е от GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories (Logan, UT, USA). Инсулинът и NAC бяха от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Фосфатният буфер (PBS) е от Caisson Laboratories, Inc. (North Logan, UT, САЩ).

Мишки с люспи Foxx1 (f-Fox01) и мишки с двоен флокс Irs1/Irs2 (df-Irs) бяха настанени и настанени, както е описано по-горе. 15, 16, 52 Накратко, мишките бяха настанени в пластмасови клетки на 12-часов светло-тъмен фотоцикъл със свободен достъп до вода и редовна диета. Преди експериментите за лечение там се претеглят мъжки мишки (на възраст от 14 до 16 седмици) и мастната маса се измерва с помощта на Bruker Minispec LF90 NMR анализатор (Bruker Optics, Billerica, MA, USA). След това мишките бяха прехвърлени в стая за биобезопасност 2 (BSL2) и инжектирани с Tam (1 mg/20 g телесно тегло) или носител (слънчогледово масло) чрез IP инжекция (веднъж дневно в продължение на 5 последователни дни). След приложението на Tam клетките се сменят на всеки 2 дни до седмица 2, когато мишките се преместват в стаята BSL1 и измерванията на теглото на телесните мазнини продължават. В зависимост от експерименталната настройка, мишките се претеглят и жертват, за да се отстрани тъканта за бързо замразяване в течен азот, на 2 или 6 седмици след третирането с Tam. Всички процедури се ръководиха от насоките на NIH и бяха одобрени от Комитета за институционални грижи и употреба на Вирджиния.

Клетъчна култура и лечение

ROS измерване

ROS в адипоцитите и мастната тъкан са измерени, както е описано по-рано, 54, 55 с пропускливо за клетките багрило 5,6-карбокси-2 ', 7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (карбокси-DCFDA, молекулярни сонди, Grand Island, NY, САЩ) Веднага замразените мастни тъкани се претеглят и прехвърлят в буферирана среда (5 mmol/L HEPES в PBS) за бързо размразяване за подобряване на дифузията на сондата. След бързо размразяване средата се изхвърля. Пробите се излагат на 8 μM карбокси-DCFDA в прясна среда и се инкубират при 37 ° С в продължение на 45 минути при разбъркване. След това средата беше отстранена и пробите бяха допълнително инкубирани в лизисен буфер (0.1% SDS, Tris-HCl, рН 7.4) в продължение на 15 минути при 4 ° С. След хомогенизиране пробите бяха центрофугирани при 16 000 xg в продължение на 20 минути при 4 ° C. ° C. Супернатантите се събират и се подлагат на флуоресцентен анализ при 530 nm с възбуждане при 485 nm, като се използва Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

За измерване на ROS в 3T3L1 адипоцити, 1-5 × 106 клетки се събират с типсин и се промиват три пъти със студен PBS, последвано от инкубация с 8 μM карбокси-DCFDA в прясна среда (5 mmol/l HEPES в PBS) и инкубиране при 37 ° С за 45 минути при разбъркване. След това средата беше отстранена и пробите бяха допълнително инкубирани в PLC лизисен буфер: 15, 52 (30 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% глицерол, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 10 mM NaPPi, 100 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4), допълнена с коктейл от протеазен инхибитор (Roche, Branchburg, NJ, USA) и 1 mM PMSF за 15 минути при 4 ° C. След хомогенизиране пробите се центрофугират при 16 000. xg за 20 минути при 4 ° С. Супернатантите се събират и се подлагат на флуоресцентен анализ при 530 nm с възбуждане при 485 nm и общият протеин се определя чрез DC протеинов анализ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) на хибрид многомодов четец на микроплаки. Synergy H4 (BioTek) Instruments, Inc.). Нивата на ROS бяха нормализирани до общия протеин за всяка клетъчна чиния.

Уестърн блотинг

За приготвяне на тъканни лизати, бързо замразените мастни тъкани се претеглят и хомогенизират с помощта на Bullet Blender (Next Advance, Averill Park, NY, USA) в PLC лизисен буфер, допълнен с коктейл от протеазен инхибитор (Roche), 1 mM PMSF, 10 μM TSA . (Trichostatin A, Selleckchem, Houston, TX, USA) и 5 ​​mM никотинамид (Alpha Aesar, Ward Hill, MA, USA). 15, 52 За клетъчните лизати, 3T3L1 адипоцитите се промиват с ледено студен PBS и се хомогенизират с Bullet Blender. Общите протеинови концентрации на лизати се определят с помощта на DC протеинов анализ (Bio-Rad). Уестърн блотинг и анализ на изображението бяха извършени, както е описано по-горе. Каталожните номера и доставчиците на антитела са както следва: разцепена заешка каспаза-3 mAb (9664) и LC3B антитяло (# 2775) от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); PPAR-гама антитяло (MA5-14889) и GAPDH антитяло (MA5-15738) от Pierce (Rockford, IL, USA) или Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA); и HO1 антитяло (3391-100) от Biovision (Milpitas, Калифорния, САЩ).

Статистически анализи

Всички резултати се изразяват като средна стойност ± SD и се анализират чрез дисперсионен анализ, за ​​да се определят стойностите на Р; P Карбокси-DCFDA

5,6-карбокси-2 ', 7'-дихлорфлуоресцеин диацетат

разцепена каспаза 3

Irs1/Irs2 мишки с двойно сплъстяване

епидидимална бяла мастна тъкан

вилична кутия O1

FoxO1 флоксирани мишки

хем оксигеназа 1

субстрат на инсулиновия рецептор

конюгат на лек верижен 3A/1B протеин с 3-фосфатидилетаноламин с микротубули

пероксизомен пролифератор активиран рецептор гама