инструменти

  • абстрактно
  • Основното
  • Прасета като експериментален модел
  • Кистозна фиброза
  • Пигментен ретинит
  • рак
  • Създаване на свине с генно инженерство
  • NSRRC
  • внос
  • Извеждане и наблюдение на здравето
  • Разпределение на проби и живи животни
  • Генетично модифицирани персонализирани модели, генерирани от PI
  • криоконсервация
  • Проучване и проучване срещу заплащане
  • заключения

абстрактно

Прасетата стават все по-важни като биомедицински модел. Поради приликите между прасетата и хората, по-доброто разбиране на основната биология на човешкото здраве и болести може да дойде от свине, а не от класически модели на гризачи. С нарастващата нужда от свински модели е изключително важно геномните инструменти, модели и услуги да са на разположение на научната общност. Много от тях са достъпни чрез Националния център за свински ресурси и изследвания (NSRRC), съоръжение, финансирано от Националните здравни институти на САЩ към Университета в Мисури. NSRRC има за цел да предостави висококачествени модели на биомедицински свине на научната общност.

Основното

Генетично модифицираните животински модели позволиха безпрецедентен напредък в биомедицинските изследвания. Много организми се използват за производство на генетично модифицирани модели като мишки, плъхове, овце, говеда 1 и свине 2. Всички тези видове са предоставили информация, която е ценна за разбирането на основната биология, както и на патогенезата на много човешки заболявания. Някои модели обаче имат ограничения в способността си да рекапитулират човешко заболяване или синдром. Например, мишките и плъховете не са оптималният животински модел за изследване на човешкото око или извършване на ортопедична хирургия поради ограничения в размера на окото или костите и ставите. В допълнение, класическите модели на гризачи не винаги рекапитулират напълно човешките заболявания като муковисцидоза (CF) 3. .

Прасетата имат много предимства пред други видове като биомедицински модел и се считат за оптимален модел за ксенотрансплантация, оценка на риска от замърсяване на околната среда и откриване на лекарства. В много отношения прасето е по-сходно, отколкото при други модели, по отношение на анатомията, физиологията и патофизиологията; филогенетично, прасетата на нуклеотидно ниво са три пъти по-близки от мишки 4. Понастоящем разполагаме с огромно количество информация за прасетата след употребата му в селското стопанство, обхващаща всички аспекти на неговата анатомия и физиология, вариращи от основни генетични реакции към околната среда до приложни аспекти като жилище 5. В допълнение, ние сме в състояние да приложим много постижения в медицинската технология, които са разработени за хора, върху модела на свине, като магнитно-резонансно изображение и сканиране на позитронно-емисионна томография, а хирургично обучение се провежда рутинно върху прасета. В този преглед ще обсъдим стойността на прасетата като биомедицински модел, както и геномни инструменти и услуги като NSRRC, които са на разположение, за да улеснят използването му в изследванията на човешкото здраве и болести.

Прасета като експериментален модел

Въпреки че е отличен модел в естественото си състояние, най-големият ефект на свинете в биомедицинската общност вероятно ще дойде от ролята му на модел на генно инженерство за конкретно човешко заболяване. Тук ще обсъдим три случая, в които генетично модифицираните свине са се доказали като изгодни модели.

Кистозна фиброза

CF е автозомно-рецесивно разстройство, причинено от мутация в гена CFTR, който регулира анионния транспорт. При приблизително 70% от хората с CF мутацията в CFTR е делеция на трите базови двойки, които кодират аминокиселина 508 (фенилаланин) на CFTR 3 протеина. Някои от симптомите на МВ включват запушване на слуз (мекониев илеус), запушени панкреатични канали, втвърден жлъчен мехур и белодробни заболявания 3. Когато CFTR генът мутира в модел на мишка, анионният канал не е функционален, но не се наблюдават класически симптоми на CF. Въпреки това, когато моделното животно е прасе с човешка мутация (т.е. делеция на фенилаланин 508), 100% от прасенцата показват класически симптоми на CF, включително мекониев илеус, чернодробни лезии и белодробни заболявания 3. Настоящият модел на свине се използва за инвазивно изследване на белодробни заболявания за разработване на нови терапии.

Пигментен ретинит

Свинските модели играят доминираща роля в изследванията на пигментозен ретинит (RP) 11. RP е човешко автозомно доминантно разстройство, при което често срещана форма на заболяването е резултат от заместването на хистидин с пролин аминокиселината в позиция 23 (P23H) в RHO гена. RP се характеризира с настъпване на нощна слепота, загуба на периферно зрение и след това загуба на централно зрение 12. През 2012 г. Ross et al. 13 разработи инбриден миниатюрен модел на прасе за RP, който възпроизвежда човешкия фенотип. Човешкият трансген с мутация P23H в човешкия RHO ген е произволно вмъкнат в свинския геном и са получени редица фенотипове13. Въпреки че има няколко други RP модели, които са рекапитулирали болестта, предимството на свинския модел е биологичното сходство между прасето и човешкото око. Друго предимство на този модел на свине е, че инбридираният миниатюрен генетичен произход на свинете улеснява развитието на клетъчни терапии. Изследователите могат да инжектират големи количества инокулум в очите на свинете, което им позволява да изучават ефектите от клетъчните терапии, без никакви объркващи ефекти от отхвърлянето 14. Този модел е използван в няколко експеримента, като например определяне дали добавката с куркумин може да спре или забави дегенерацията на пръчковидни фоторецептори. .

рак

Ракът е голяма колекция от заболявания, които обикновено се характеризират с ненормален клетъчен растеж. Мутациите в KRAS съставляват около една четвърт от човешкия рак, а мутациите в p53 - друга трета. Разработихме индуцируем модел на рак на свине с флоксифициран стоп кодон между пилешкия бета актинов промотор и мутантните форми на KRAS G1D2 и p53 R172H. Този модел на рак на свине позволява индуциране на тумори във всяка тъкан или орган чрез прилагане на CRE рекомбиназа в желаната тъкан. CRE насърчава рекомбинацията между двете места на loxP и премахва стоп кодона. Премахването на стоп кодона води до транскрипция и последващо транслация на двата гена, индуциращи рак. Първоначалната работа in vitro с клетки, изолирани от животни основатели, разкрива, че трансгенът е бил функционален, когато аденовирусът е бил използван за доставяне на Cre до клетките in vitro. Клетъчната морфология, времето на разделяне и времето на клетъчна миграция са различни в клетъчната линия на раковия модел в сравнение с контролните линии 16. В допълнение, 12 от 14 мишки, инжектирани с клетки от адено-Cre-индуцирания модел на свински карцином, развиват измерими тумори. И накрая, тумори бяха индуцирани от adeno-Cre на три различни места при свине KRAS G1D2 и p53 R172H 16 .

Създаване на свине с генно инженерство

Технологиите за производство на генетични модификации на генома на свинете са се развили значително през последните три десетилетия. В исторически план генното инженерство на свинете се извършва чрез добавяне на трансгени към произволни места в генома. Използвайки техника за микроинжектиране, геномни конструкции бяха вмъкнати в зиготи на пронуклеи 17, което доведе до случайни инсерционни събития с потенциал да предизвикат мутации на инсерция 18. Вмъкванията могат да се появят като едно или повече копия на трансгена, интегриращи се в едно или повече места в генома. В допълнение към случайността на вмъкването, някои от инжектираните трансгени могат да се интегрират само след разцепване на зиготата, т.е. по време на двуклетъчния стадий. Интеграция по време на двуклетъчния стадий може да се случи на различни места (или изобщо не) в генома в двата бластомера, което води до мозаечен ембрион и животно 19. Ако потомството на двата бластомера допринесе различно за зародишната линия, тогава трансгенът може или не може да бъде прехвърлен към потомството. Но дори и с тези предупреждения, трансгенезата чрез пруклеарно инжектиране все още е мощен инструмент за производството на нов протеин при свинете.

Последните и най-важни постижения в генното инженерство на свинете са използването на технологии за генно инженерство като цинкови и пръстови нуклеази 29, 30, транскрипционни активатор-подобни ефекторни нуклеази 31, 32, 33 и клъстерирани редовно разположени кратки палиндромни повторения. Система Cas9 (CRISPR/Cas9) 34. Тези инструменти са високо ефективни и могат да бъдат проектирани така, че да не оставят генетични следи, като избираем маркер. Всъщност системата CRISPR/Cas9 е толкова ефективна, че инжектирането в зиготи (ако са предварително зададени отделни CRISPR) може да доведе до това всички потомци да имат модифицирани алели 34. Системата CRISPR/Cas9 ни позволи да редактираме свинския геном чрез изтриване на гени и насочване на вмъкване на донорска ДНК; дори има потенциал да модифицира една база в генома. Благодарение на новите техники за модифициране на гените е възможно да се предвиди създаването на практически всяка модификация или комбинация от модификации при свинете, като по този начин се премахват всички останали генетични бариери, които са ограничавали използването им в миналото.

NSRRC

Маса в пълен размер

внос

Много изследователи вече са разработили модели за конкретни приложения. Поддържането на линията и отговарянето на искания от други следователи може да бъде трудно за независимите съоръжения. НСРР може да облекчи тежестта на разследващия донор от тежестта на разпределението. Съществуващите модели могат да бъдат дарени на NSRRC, където те ще бъдат поддържани и предоставени на други изследователи. Разследващите могат да дарят модела NSRRC, при условие че моделът се разпространява свободно на други следователи в институции с нестопанска цел. Разследващият донор ще предостави на NSRRC необходимата информация за модела, като генетична модификация (ако има такава), фенотип, очаквани заявки за година на линия, здравословно състояние и щам. След това Консултативният комитет на NSRRC ще определи дали дарения модел ще бъде приет в центъра. След приемането изследователят и NSRRC щяха да определят модела на дарителския план. Типичните дарения се извършват или чрез замразени проби като сперма, събиране на специфични клетъчни типове за клониране или криоконсервация, или под формата на живи животни, ако здравните условия позволяват.

Извеждане и наблюдение на здравето

Всички модели на NSRRC се помещават или в стандартно жилище, или в нашето специално съоръжение без патогени. Моделите, дарени от NSRRC, се пренасочват към едно от тези съоръжения за отстраняване на патогени от донорската институция. Повторната деривация може да се извърши по няколко метода, които могат да включват чисто цезарово сечение, ембриотрансфер, инсеминация или клетки, използвани за ядрен трансфер на соматични клетки. Рутинното наблюдение на животните в нашите съоръжения преди, по време и след повторното извличане гарантира, че моделите в NSRRC имат най-високите здравни стандарти. Здравето се следи за заболявания, включително репродуктивни и респираторни болести по свинете, Leptospira, Mycoplasma hyopneumoniae, свински цирковирус II и наскоро свински вируси и делта-коронавирус. Тестовете за други заболявания се развиват и развиват, както се изисква от изследователските програми на главния изследовател (PI). Пример за това е разработването и валидирането на тест за цитомегаловирус, тъй като вторичната цитомегаловирусна инфекция може да доведе до отказ на свински органи, които се предават на павиана 35. Мониторингът на много патогени се извършва с помощта на тестове, разработени от NSRRC за вътрешно тестване на фекални, орални или кръвни проби.

Разпределение на проби и живи животни

Поради ограничените съоръжения и експертни познания на свинете на много места, NSRRC може да предостави конкретни проби, без следователят да се налага да обновява съществуващата инфраструктура и опит. Изследователят може да поиска всички модели свине, достъпни чрез NSRRC. Моделите могат да се разпространяват като клетки, тъкани, органи или живи животни. Пример за проби, разпространени чрез NSRRC, е даден в Таблица 2. Когато изследователят поиска проби, NSRRC подготвя животните за вземане на проби. В случай на проби, взети от служители на NSRRC, изискащият изследовател се изисква да предостави подробен протокол за вземане на проби, както и подробности за условията на превоз. Искащият изследовател може също да вземе проби лично, като посети съоръжението на NSRRC.

Маса в пълен размер

В допълнение към пробите, живите животни могат да бъдат раздадени на изследователите, които искат. Животните могат да бъдат изпращани в институции за специфични тестове, нова терапия или вземане на проби. Институциите могат също така да приемат животни, за да създадат собствена колония за разплод. Живите животни обикновено напускат NSRRC най-рано на възраст от 4 до 5 седмици, така че животните се отбиват и започват преди транспортиране на твърда храна; обаче в някои ситуации може да се транспортират новородени. NSRRC ще работи с молещия изследовател и приемащото съоръжение, за да определи най-добрия начин за разпределение на животните и да гарантира, че здравният статус на приемащата институция не е нарушен.

Генетично модифицирани персонализирани модели, генерирани от PI

Всеки главен изследовател може да поиска от NSRRC да разработи персонализиран модел на свине. Ако изследователят се финансира от NIH, понастоящем NSRRC може да изготви този модел безплатно за молещия изследовател; след характеризиране на модела обаче той ще се разпространява свободно. Поради факта, че моделите се разпространяват, задължението на политиката за споделяне на NIH за безвъзмездната помощ на NIH PI е изпълнено. PI, които нямат финансиране от NIH, също могат да поискат свои собствени модели, но в тези случаи нашият модел се оценява от нашия консултативен комитет. Необходимият модел трябва да отговаря на следните критерии: той може да се използва в няколко дисциплини и е вероятно да бъде много търсен. Ако Консултативният комитет отхвърли заявката за модела или ако изследователят желае да ограничи разпространението на модела, може да се поиска производство въз основа на такси за услуги. Персоналът на NSRRC може да помогне във всички аспекти на моделирането, от проектирането и разработването до грижите за животните основатели. Понастоящем използваме инструменти за модифициране на гени (CRISPR/Cas9), за да произведем много от необходимите модели 34. NSRRC обикновено произвежда три до пет модела годишно.

криоконсервация

Плазмата от всички генетично модифицирани и диви животни се запазва в различни формати, включително ембриони, соматични клетки и сперматозоиди. Криоконсервацията предоставя на NSRRC способността да поддържа линии без непрекъснато производство, както и да предотвратява катастрофални загуби поради огнища на болести. За да се осигури поддръжка на линията, дублирани проби се съхраняват извън площадката във вторичното хранилище. Криоконсервирани проби могат да бъдат изпращани на молещия изследовател за създаване на животни на място в тяхното предприятие. В допълнение, NSRF може да предостави на изследователя услуги за криоконсервиране и съхранение на техния генетично модифициран модел на свине; тези, които не искат да дарят своите модели, все още могат да получават услуги, но въз основа на такси за услуги.

Проучване и проучване срещу заплащане

NSRRC провежда изследвания, които ще се възползват от производителността му по отношение на изпълнението на неговите функции. NSRRC провежда изследвания в областта на генното инженерство, ядрения трансфер на соматични клетки, криоконсервацията и разработването на тестове за мониторинг на здравето. Освен това НСРР ще подпомага изследователите с техните биомедицински изследователски проекти. Персоналът на NSRRC и искащите разследващи ще обсъдят проекта, за да определят дали е възможно NSRRC да провежда изследвания в своето съоръжение. Изпълнението на много взискателни проекти и проекти, изискващи високоспециализирано оборудване, може да бъде по-взискателно за NSRRC и може да се наложи да се извърши в съоръжението на молещия УИ. Изследователят и NSRRC също ще обсъдят бюджета и времевата рамка, необходими за завършване на проекта.

заключения

През последното десетилетие се наблюдава значително увеличаване на използването на свинете като модели за човешко здраве и болести. Независимо дали се използват в естествено състояние или са генно инженерни, моделите на свине се превръщат в биомедицински модел на избор, до голяма степен благодарение на нарастващата им способност да рекапитулират различни човешки заболявания. С ограничен опит и оборудване в цялата страна, необходимостта от централен ресурсен център се превърна в приоритет. NSRRC е създаден, за да служи като хранилище за ценни модели на свине за биомедицински изследвания, прехвърляйки тежестта за поддържане и разпространение на модели на свине от изследователя към национален ресурс. Освен това NSRRC създава и разпространява собствени свине, генерирани от PI модели. Ние сме тук, за да помогнем на общността за изследване на свине да положи основите на своите биомедицински изследвания.