елементи

абстрактно

EBI2 е свързан с G протеин рецептор, активиран от оксистерол 7а, 25-дихидроксихолестерол (7a25HC) и регулира Т-клетъчно-зависимия отговор на антителата и миграцията на В-клетките. Наскоро установихме, че EBI2 се експресира в човешките астроцити, регулира вътреклетъчната сигнализация и модулира миграцията на астроцитите. Тук докладваме, че лечението на LPS в миши астроцити променя нивата на EBI2 и оксистерол иРНК, което предполага, че сигналният път EBI2 е чувствителен към LPS-медиирано имунно предизвикателство. Също така открихме, че кондиционираната среда, получена от LPS-стимулирани миши астроцити, индуцира миграция на макрофаги, която се инхибира от антагониста на EBI2 NIBR189. Тези резултати демонстрират ролята на сигналния път EBI2 в астроцитите като сензор за имунна стимулация и за комуникация с вродени имунни клетки като макрофаги.

За да определим други роли в сигналния път на EBI2 в астроцитите, ние изследвахме неговата модулация от LPS в миши астроцити. Също така изследвахме дали EBI2 сигнализирането играе роля в астроцитната клетъчна комуникация с макрофаги.

резултатът

LPS-стимулирана мишка, обусловена от астроцити, предизвиква миграция на макрофаги

Има все повече доказателства, че астроцитите произвеждат редица сигнални молекули (цитокини, хемокини, растежни фактори, азотен оксид и други), които позволяват комуникация с вродени имунни клетки и евентуално насърчават тяхната миграция24. Първо се опитахме да покажем, че LPS-стимулираните астроцити могат да индуцират миграцията на вродени имунни клетки и в това проучване се фокусирахме върху способността им да регулират миграцията на макрофагите. Среда, допълнена със 7α25HC (0,01 μM) или събрана от LPS (100 ng/ml, 0-24 h) миши астроцити (LPS-Astro-Med), бяха приложени към долната камера на миграционната система за миграция xCELLigence®, съдържаща RAW264 макрофаги. 7 клетки в горната камера (фиг. 1а). Този LPS-Astro-Med индуцира значителна миграция на RAW264.7 клетки на макрофаги по зависим от времето начин в сравнение с нетретираните астроцити (192.2% +/- 50.2% след 6 часа, 211.0% +/- 66.5% след 8 часа) (Фиг. 1б). Средата от третирани с LPS астроцити за 2, 4 и 24 часа не индуцира миграция на макрофаги, което показва времева реакция и също така показва, че добавеният LPS сам по себе си не променя директно миграцията на макрофаги в тези серии експерименти (Фиг. 1b).

играе

Лечение на първични миши астроцити с LPS (100 ng/ml), индуцирани нива от 25HC след четири и осем часа ( а ) 7a25HC след осем и 15 часа ( б ) и 7p25HC след четири, осем и 15 часа ( ° С ). Данните са представени като средно +/− SEM, n = 3 - 6. еднопосочен ANOVA с пост-тестове на Dunnett, * p> 0,05, ** p> 0,01, *** p> 0,001 спрямо съответния контрол.

Изображение в пълен размер

EBI2 регулира миграцията на макрофаги, индуцирана от мишка, обусловена от астроцити

И накрая, за да се определи дали наблюдаваните миграционни ефекти, индуцирани от LPS-Astro-Med, зависят от EBI2, средата е допълнена с EBI2 антагонист (NIBR189 ref. [30], 10 μM). Показано е, че ефектите на оксистеролите върху миграцията на макрофагите са частично инхибирани от EBI2 антагониста (NIBR189), което показва EBI2-медиирана сигнализация 12. В съответствие с това предишно проучване 12, EBI2 антагонистът NIBR189 инхибира ефектите на 7α25HC върху миграцията на макрофагите (109,5% +/- 57,9%), който екзогенно се прилага към долната камера на миграционната система xCELLigence®. Важно е, че кондиционираната среда, събрана от LPS-стимулирани астроцити в продължение на 6 и 8 часа (LPS-Astro-Med) и допълнена с EBI2 антагонист (NIBR189), намалява наблюдаваната миграция на макрофаги (Фиг. 4). За този ефект се наблюдава тенденция на спад, което предполага частично участие на EBI2 в регулирането на миграцията на макрофаги (Фиг. 4). Като цяло данните предполагат, че LPS-стимулираните астроцити могат да предизвикат миграция на макрофаги и в допълнение, че EBI2 може да регулира тази клетъчна кръстосана препратка.

Експерименталната настройка може да бъде намерена на фиг. Както 7α25HC (0,01 μM), така и кондиционирана астроцитна среда, получена от 6 и 8 часа третирани с LPS астроцитни мишки, предизвикват миграция на макрофаги. Добавянето на EBI2 антагонист (NIBR189, 10 μM) към 7α25HC или третирана с LPS миша астроцитна среда отслабва ефектите на медиирана от астроцити среда върху миграцията на макрофаги. Данните са представени като средно +/- SEM n = 3, еднопосочна ANOVA с Bonferroni пост-тестове, * p 21 показа, че Ch25h-дефицитните макрофаги имат противовъзпалителен фенотип и животните показват нарушен ход на EAE, Chalmin и колеги 26 установи, че делецията на Ch25h значително отслабва хода на EAE заболяването, като ограничава предаването на патогенни CD4 + Т клетки до централната нервна система. Доказано е също така, че сигналният път EBI2 (по-специално рецепторът и 7a25HC и неговите метаболитни ензими) отговаря на имунното предизвикателство в първични макрофаги, получени от моноцити 12. В това проучване ние изследвахме сигнализирането и функцията на EBI2 в астроцитите на мишки и демонстрирахме ролята на EBI2 в клетъчната комуникация между астроцитите и макрофагите.

Тук открихме, че в отговор на LPS, първичните миши астроцити значително намаляват експресията на EBI2 иРНК. Нашите данни също така показват, че мишите астроцити регулират нивата на 7a25HC иРНК, синтезиращи и разграждащи ензими в отговор на предизвикателство с LPS. Можем само да предположим причините за относително по-бавните времеви активирания на CYP7B1 и HSD3B7 в сравнение с активирането на CH25H, което в момента остава неясно. Важно е, че тези данни са в съответствие с експресията на иРНК на тези ензими в третирани с LPS макрофаги, което показва, че експресията на CH25H достига пикове след два часа, иРНК CYP7B1 може да се наблюдава по време на лечението с LPS и транскриптите на CYP27A1 и HSD3B7 се регулират в продължение на два или повече часа шест часа 12 .

Установихме, че повишеното регулиране на синтетичните ензими е придружено от повишаване на нивата на 7a25HC в третираната с миши астроцити среда след третиране с LPS. Констатациите, че LPS повишава нивата на 7a25HC в средата, обусловена от миши астроцити, са свързани със способността на тази среда да стимулира миграцията на макрофаги. Също така открихме, че кондиционираната среда, получена от LPS-стимулирани астроцити, предизвиква миграция на макрофаги, която е частично отслабена от антагониста на EBI2 NIBR189. По този начин регулирането на сигналния път на EBI2 (както рецепторите, така и ензимите, които контролират нивата на лигандите) в астроцитите изглежда насърчава миграцията на макрофагите.

В обобщение, данните показват, че молекулите в сигналния път на EBI2 са чувствителни към провъзпалителни сигнали и че EBI2 играе роля в комуникацията между астроцитите и макрофагите.

методи

Клетъчна култура

Всички процедури за животни бяха одобрени от Комитета по институционална етика (Novartis Pharma, Базел Швейцария и Тринити Колидж Дъблин, Ирландия). Методите са извършени в съответствие с одобрените насоки. Миши астроцити 27, 28, 29, 30 и клетки от миши макрофаги (RAW264.7) 12 се култивират, както е описано по-горе. Преди стимулацията астроцитите бяха гладувани в среда без серум в продължение на 4 часа. След това астроцитите бяха третирани с LPS (100 ng/ml, Sigma) със или без EBI2 антагонист (NIBR189, Novartis) 31 и/или 7a25HC (приготвен като 10 mM основен разтвор в 90% DMSO).

Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (RT-qPCR)

Високопроизводителна течна хроматография и тандемна масспектрометрия (UHPLC-MS/MS)

Тестове за миграция

Миграцията на миши макрофаги (RAW264.7) се извършва при 37 ° C и 5% CO 2 в овлажнен инкубатор, използвайки xCELLigence® контролирана миграционна платформа (Roche Applied Biosciences) с 16-ямкови CIM плаки, както е описано по-горе 22. Накратко, клетъчната миграция през електродния масив от горната към долната камера се измерва чрез увеличаване на импеданса. Долната камера на плочата беше запълнена с обработена с астроцити среда или без серум, допълнена със 7α25HC (0,01 μM) със или без EBI2 антагонист NIBR189 (10 μM). Клетъчната миграция се записва веднага след поставяне на плаката и записва в продължение на 2 часа.

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Rutkowska, A. et al. Сигнализиращият път EBI2 играе роля в кръстосаните препратки между клетките между астроцитите и макрофагите. Sci. Представител. 6, 25520; doi: 10.1038/srep25520 (2016).

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.