елементи

абстрактно

Честотата на затлъстяването нараства през последните десетилетия 1. Според Световната здравна организация затлъстяването и наднорменото тегло се свързват с повече смъртни случаи с по-ниско тегло в цял свят. Затлъстяването и неговият метаболитен синдром се превърнаха в здравословни, социални и икономически проблеми. Затлъстяването се характеризира с прекомерно натрупване на мастна тъкан в тялото 2; докато централното затлъстяване с мастна тъкан се натрупва главно в коремните подкожни и висцерални депа 3, 4. Тези подкожни мастни тъкани са силно свързани с инсулинова резистентност 3, 4, 5 и хората със затлъстяване са склонни към метаболитни усложнения 3 .

Каноничната роля на адипоцитите е да служат като регулатор за поддържане на енергийния баланс в тялото 6. Триацилглицеролът (TG) се съхранява в цитозолни липидни капчици в адипоцитите по време на излишна енергия и се мобилизира за освобождаване на мастни киселини чрез липолиза, когато е необходима енергия или под хормонално влияние 7. Затлъстяването обаче винаги е свързано с намален отговор на стимулирана с катехоламин 8 липолиза, тъй като при затлъстели индивиди бета-адренергичният рецептор 8-стимулирана липолиза е нарушена. Адипоцитите от индивиди със затлъстяване имат по-ниски нива на аденилил циклазна активност при хормонално стимулирани условия в сравнение с адипоцитите от контролните групи със затлъстяване 9, 10. Проучването показа, че след стимулация с дибутирил сАМР, максималният липолитичен капацитет е по-нисък при адипоцити, изолирани от индивиди със затлъстяване, отколкото при адипоцити, изолирани от лица със затлъстяване 8. Това откритие допълнително предполага, че адипоцитите от затлъстели лица имат нарушен липолитичен отговор на бета-адренергична стимулация.

Schisandrin B (SchB) е едно от най-разпространените и активни производни на дибензоциклооктадиен, открити в плодовете на Schisandra chinensis. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill се намира в северен Китай, Япония, Корея и прилежащите райони в Русия и се използва като билкови лекарства в здравеопазването 18. Към днешна дата се съобщава, че SchB има хепатопротективни свойства 19, 20, намалява съдържанието на чернодробни липиди 21, подобрява хомеостазата на глюкозата и повишава чувствителността към чернодробния инсулин22. Неговата функционална роля в регулирането на адипоцитния липиден метаболизъм обаче не е проучена. В това проучване ние изследвахме функционалната роля на SchB в намаляването на подкожната мастна тъкан чрез регулиране на метаболизма на адипоцитните липиди.

резултатът

SchB намалява съдържанието на липиди в адипоцитите на 3T3-L1

SchB е производно на дибензоциклооктадиен (фиг. 1а). Първо, използвахме UHPLC анализ, за ​​да потвърдим чистотата на SchB, която беше 97% (фиг. 1б).

метаболизъм

Шизандрин Б. ( а ) Структура на Schisandrin B (SchB); ( б ) хроматограма на SchB в UHPLC анализ.

Изображение в пълен размер

В това проучване ние изследвахме дали SchB регулира липидния метаболизъм в белите адипоцити. Използвахме 3T3-L1 адипоцити като in vitro модел. За да определим субцитотоксичната концентрация на SchB за експерименти, третирахме 3T3-L1 адипоцити с SchB при различни концентрации за 24 часа и извършихме MTT анализ. Както е показано на ФИГ. 2а, IC50 на SchB за 3T3-L1 адипоцити е 172.8 μM. След това третирахме 3T3-L1 SchB адипоцити при 80 μM на петия ден по време на диференциацията. Интересното е, че открихме, че SchB намалява броя на липидните капчици (фиг. 2б) и съдържанието на липиди в тези адипоцити (фиг. 2в, г). Тези данни предполагат, че SchB регулира липидния метаболизъм в 3T3-L1 адипоцитите.

SchB намалява съдържанието на липиди в адипоцитите на 3T3-L1. а ) Анализ на жизнеспособността на SchB клетки върху 3T3-L1 адипоцити. ( б ) Липидни капчици в контрола и третирани с SchB (80 μM) 3T3-L1 адипоцити. Количествено определяне на липидно оцветяване в контрола и третирани с SchB адипоцити 3T3-L1 чрез ( ° С ) Маслено червено O a ( д ) Нилско червено. Показани са средни стойности ± SE, n = 3 отделни експеримента. * стр

SchB индуцира липолиза в 3T3-L1 адипоцити. ( а ) Представител Western показва протеиновите експресии на ATGL, HSL и фосфо-HSL в контрола и третирани с SchB (80 μM) 3T3-L1 адипоцити и ( б ) количествено определяне на западния сигнал за HSL и p-HSL. ( ° С ) нива на сАМР в контрола и третирани с SchB адипоцити 3T3-L1. Показани са средни стойности ± SE, n = 3 отделни експеримента. * p a p b p

SchB увеличава експресията на гени за окисление на мастни киселини в адипоцитите на 3T3-L1. а ) Експресия на ацил-КоА оксидаза 1 (Acox1), малат дехидрогеназа 2 (Mdl2), карнитин палмитоилтрансфераза 1 (CPT1), субединица цитохром с оксидаза VIIIb (Cox8b), много дълговерижна ацил-КоА дехидрогеназа (AcadB) o (80 μM) 3T3-L1 адипоцити. Показани са средни стойности ± SE, n = 3 отделни експеримента. * p 7, 12, 13, 14, 16, генерирахме миши модел на диета, индуцирана от затлъстяване (DIO) за проучвания ex vivo и in vivo, за да изследваме ефектите на SchB върху адипоцитния липиден метаболизъм. В това проучване използвахме миши модел на DIO, тъй като тези DIO мишки не са генно инженерни. В допълнение, те имитират настоящото разпространение на затлъстяването, при което повечето хора развиват затлъстяване с прекомерен прием на калории. Определихме миши модел на DIO чрез хранене на мишки C57BL/6 с високо съдържание на мазнини (HFD) или съответна контролна диета в продължение на 12 седмици. Както е показано на ФИГ. 6а, започвайки от седмица 10, телесното тегло на мишки, хранени с HFD, е значително по-голямо от теглото на мишките на контролната диета (Фиг. 6а). Процентното увеличение на теглото е 62,06 ± 5,55% за мишки, хранени с HFD и 33,49 ± 3,41% за мишки, хранени с контролна диета, хранени 12 седмици.

Мишки, индуцирани от диета, предизвикана от затлъстяване. ( а ) Телесно тегло и ( б ) различно тегло на мастните депа при DIO мишки. Подкожна мастна тъкан (SAT), епидидимална мастна тъкан (EAT), периренална мастна тъкан (PAT) и кафява мастна тъкан (BAT) при DIO мишки. Показани са средните стойности ± SE, n = 10 мишки във всяка група. * стр

SchB увеличава липолизата в мастните накладки, отделени от DIO мишки в проучване ex vivo. ( а ) Представител Western показва експресията на HSL и β-HSL в подкожни адипоцити, разделени от DIO мишки и ( б ) количествено определяне на западните сигнали. NEFA пусна през ( ° С ) подкожна мастна тъкан (SAT), ( д ) епидидимална мастна тъкан (EAT) и ( д ) периренална мастна тъкан (PAT), дисектирана от DIO мишки. Показана е средната стойност ± SE, n = 5 от отделните експерименти. * p a p b p

Подкожната мастна тъкан е силно свързана с метаболитен синдром 3, 4, 5. Натрупването на подкожна мастна тъкан при затлъстели индивиди се дължи отчасти на подкожните адипоцити, устойчиви на липолиза 3. HSL контролира регулаторния етап при липолиза 11, експресията и активността на HSL са по-ниски в подкожните адипоцити, отколкото в адипоцитите от други мастни депа 25. В допълнение, подкожните адипоцити имат по-ниска чувствителност към индуцирана от катехоламин липолиза и по-висока чувствителност към инсулинови антилиполитични ефекти в сравнение с други адипоцити 3. Следователно ограниченият прием на храна и упражненията обикновено намаляват висцералната мастна тъкан много повече от подкожната мастна тъкан 3, 26. Освен това в затлъстяване, придружено от инсулинова резистентност, индуцирана от катехоламин липолиза в белите адипоцити обикновено се нарушава 15, 27, което също води до натрупване на мастна тъкан при затлъстели индивиди.

Нашето проучване показа, че SchB увеличава липолизата и експресията на гена за окисление на мастни киселини в подкожните адипоцити при DIO мишки, което предполага нов терапевтичен подход за намаляване на подкожната мастна тъкан при затлъстели индивиди. Sch B е естествено съединение, изолирано от нетоксични китайски лечебни билки. Проучванията върху животни показват, че продължителното лечение на SchB няма забележим неблагоприятен ефект28. Нашите данни също така показват, че лечението с SchB не е причинило забележим неблагоприятен ефект при мишки или индуцирана апоптоза в адипоцитите (данните не са показани), което предполага, че SchB е безопасно терапевтично средство.

Нивата на SchB след приложение на Schisandra са измервани в мишка плазма и данните показват, че SchB е бил максимален в стомаха 15 минути след интрагастрално приложение и е достигнал максимални концентрации във всички тъкани 2 часа след приложението. След интравенозно инжектиране, SchB се разпределя главно в плазмата, черния дроб и бъбреците 15 минути след инжектирането. Тези проучвания предполагат, че SchB не е токсичен при животински модели. Разпределението на SchB в подкожната мастна тъкан след интрагастрално приложение или интравенозно инжектиране не е проучено 36. В нашия експериментален дизайн използвахме подкожна инжекция, която може да помогне за локализирането на Sch B в подкожната мастна тъкан, за да се постигне максимален ефект срещу затлъстяването. Дозата от 0,4 g/kg при мишки съответства на доза от 0,03 g/kg при хора. Въз основа на Проучването на растителните лекарства (HMC), публикувано от Фармакопейната конвенция на САЩ (USP), екстрактът от сухи зрели плодове на Schisandra chinensis (Turcz.) Baill съдържа не по-малко от 90% и не повече от 110% от общия лиганд включително \ t шизандрин B (y- шизандрин, C23H28O6), шизандрол B (C23H28O7) и шизандрин A (дезоксишизандрин, C24H32O6) на суха основа. Проучването също така показа, че съдържанието на лигнан в десет проби от Schinsandra chinensis, събрани от различни райони в Китай, е различно 37 .

Нашето проучване ясно демонстрира SchB-регулиран адипоцитен липиден метаболизъм, повишена PKA-медиирана HSL активност, повишено освобождаване на мастни киселини и експресия на ген за окисление на мастни киселини в подкожни адипоцити при DIO мишки. Нашите данни изясняват потенциалната терапевтична употреба на семена Sch B или Schisandra chinensis, съдържащи Sch B, за да се намали затлъстяването и съответно състоянията, свързани със затлъстяването, свързани със затлъстяването.

Материали и методи

материали

Schisandrin B (SchB) е закупен от Ningli Technology Co. ООД (Кунмин, Китай). 3T3-L1 адипоцити са закупени от American Type Culture Collection (ATCC). Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM), фетален телешки серум, пеницилин, стрептомицин, балансиран солев разтвор на Hank (HBSS) и Fluo-3/AM са закупени от Life Technologies Limited. Антитела за адипоцитна триглицеридна липаза (ATGL), хормоночувствителна липаза (HSL), β-HSL (серин 563 и серин 565), разцепена каспаза 3 и GAPDH са закупени от Cell Signaling или Santa Cruz Biotechnology Inc. изопротеренол, свободен глицеролов реагент, глюкоза, BSA без мастни киселини, червено масло, червено Нил, хематоксилин и еозин, диметилсулфоксид и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил тетразолиев бромид (MTT ) са закупени от Sigma-Aldrich Chemical Co. H89 е закупен от Calbioch. CAY10499 е закупен от Cayman Chemical. Всички органични разтворители са с HPLC клас от Sigma-Aldrich Chemical Co.

3T3-L1 клетъчна култура и диференциация на адипоцитите

3T3-L1 адипоцити бяха култивирани в модифицирана от Dulbecco есенциална среда (DMEM), съдържаща 25 mM глюкоза и допълнена с 10% фетален телешки серум и 100 IU/ml пеницилин G и 0,1 mg/ml стрептомицин. За да се индуцира диференциация, сливащите се 3T3-L1 клетки бяха третирани с диференциращ коктейл, съдържащ 1 μM дексаметазон, 0.5 mM метилизобутилксантан и 1.7 μM инсулин. След 48 часа диференциращият коктейл беше заменен с поддържаща среда, съдържаща инсулин, в продължение на 2 дни, преди да се премине към културална среда без инсулин 34 .

Работа с животни

Всички експерименти с животни бяха одобрени и проведени в съответствие с насоките на Университета на Хонконгския баптистки университет и бяха одобрени от Комитета за изследвания на човека и животните на Университета и Министерството на здравеопазването, Специален административен район на Хонконг. Закупихме 5-седмични мъжки мишки C57BL/6 (C57) от китайския университет в Хонг Конг. Мишките бяха избрани на случаен принцип, за да имат или контролна диета (D12450J Research Diets) или диета с високо съдържание на мазнини (D12762 Research Diets), която се използва за предизвикване на затлъстяване. Диетата и водата се прилагат ad libitum. Теглото на всяка мишка се записва ежеседмично. След 12-седмична диетична интервенция в експериментите са използвани утвърдени модели на диета-индуцирано затлъстяване (DIO). За експерименти in vivo, на DIO мишки се прилага или SchB чрез подкожно инжектиране на 0,4 g/kg/ден в 0,02 ml диметил сулфоксид, или самостоятелно носител (0,02 ml диметил сулфоксид) като контрола за 5 дни. Промените в поведението, телесното тегло и приема на храна на тези мишки се записват ежедневно.

Изолиране на адипоцити

Изолирането на адипоцити от мастната тъкан се извършва, както е описано другаде 38. Накратко, мастната тъкан, събрана от мишки, се усвоява в продължение на 1 час при 37 ° C с колагеназа в буфер на Krebs-Ringer (KRB; 12 mM HEPES, 121 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4 и 0,33 mM CaCl 2), допълнена с 3 mM глюкоза и 1% BSA без мастни киселини, филтрирани през найлонова мрежа. Адипоцитите бяха отстранени от горната фаза след центрофугиране. Изолираните адипоцити бяха преброени с помощта на хемоцитометър 39 .

липолиза

Мастните накладки от DIO мишки бяха изрязани и нарязани на проби от 50 mg и инкубирани при 37 ° C без разклащане в KRB (12 mM HEPES, 121 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 0.33 mM CaCl 2), съдържащи 2% мазнини киселини. BSA и 0,1% глюкоза 38 в присъствието на SchB или носител. Към този момент, NEFA и освобождаването на глицерол се измерват в аликвотни части на инкубационен буфер, като се използва съответно LabAssay NEFA комплект (Wako Chemicals) и свободен глицеролов реагент. За измерване на липолиза в 3T3-L1 адипоцити, клетките се промиват с KRB и се инкубират с KRB, допълнена с 2% BSA без мастни киселини и 0,1% глюкоза в присъствието на SchB или носител. Като положителна контрола се използва изопротеренол. Към този момент, NEFA и освобождаването на глицерол се измерват в аликвотни части на инкубационен буфер, като се използва LabAssay NEFA комплект и свободен глицеролов реагент. Всяко лечение се извършва в три екземпляра.

Тест за жизнеспособност на клетките

Цитотоксичността на SchB върху 3T3-L1 адипоцитите се оценява чрез анализ на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT). Клетките в 96-ямкови плаки се третират с SchB и към всяка ямка след инкубация се добавят 20 μl разтвор на МТТ (5 mg/ml). Плаките се инкубират допълнително при 37 ° С в продължение на 4 часа преди добавянето на 100 μl DMSO. Оптичната абсорбция се определя при 570 nm, като се използва спектрофотометър на микроплаки. Всяко лечение се извършва в три екземпляра.

Маслено оцветяване Red O

Адипоцитите, третирани с 3T3-L1 или SchB, бяха оцветени с прясно приготвен работен разтвор Oil Red O в продължение на 20 минути при стайна температура. За количествено определяне на оцветяването, масленият Red-O се екстрахира от клетките с изопропанол, съдържащ 4% Nonidet P-40 и след това се измерва оптичната плътност при 520 nm 40. Всяко лечение се извършва в три екземпляра.

Нил червено оцветяване

3T3-L1 адипоцити, с вехикулум или SchB обработка, се оцветяват с 1 μM Nile Red в балансиран солев разтвор на Hank (HBSS) за 15 минути. Проби от 10 000 нилски червени клетки бяха преброени с помощта на проточен цитометър (BD Bioscience) 41. Всяко лечение се извършва в три екземпляра.

Оцветяване с хематоксилин и еозин за подкожна мастна тъкан

SAT бяха фиксирани в 10% буфериран формалин, вградени в парафин, нарязани на 6 μm дебели части и оцветени с хематоксилин и еозин. .

Western blot анализ

Анализът на Western blot се извършва, както е описано. Накратко, нитроцелулозна мембрана, носеща прехвърлените протеини, беше инкубирана при 4 ° С за една нощ със съответно 1: 1000 антитяло.

Анализ в реално време на полимеразна верижна реакция

Общата РНК се екстрахира с Trizol реагент (Invitrogen) и се третира с DNase 1 (Invitrogen). РНК (2 μg) се транскрибира обратно с олиго-dT, използвайки M-MLV обратна транскриптаза (Promeg), съгласно протокола на производителя. PCR в реално време се извършва, като се използва зелена реакционна смес SYBR в бърза PCR система в реално време ABI 7500 (Applied Biosystemsm). Данните за генната експресия бяха нормализирани до ендогенен контрол бета-актин. Относителните нива на експресия на гените бяха измерени съгласно формулата 2-ACt, където ACt е разликата в стойностите на праговия цикъл между целите и β-актина. Всички проби бяха анализирани в три екземпляра.

определяне на сАМР

Нивата на CAMP в адипоцитите са измерени, както е описано в 42. Накратко, 3T3-L1 адипоцитите бяха третирани или с SchB при посочената концентрация, или с носител като контрола за 6 часа. След това адипоцитите се промиват с PBS и се лизират за измерване на cAMP чрез имуноанализ (BioVision), съгласно инструкциите на производителя. Количествата адипоцитни протеини във всяка група са измерени по метода на Брадфорд. Всяко лечение се извършва в три екземпляра.

Подготовка на пробата за LC/MS

3T3-L1 адипоцитите бяха третирани със 120 μM SchB или DMSO като носител за 24 часа. Липидите бяха извлечени от тези клетки за липидомичното изследване. Към всяка проба се добавят 0,3 ml 0,5 M KH 2 PO 4, 1,5 ml хлороформ и 0,5 ml метанол. След завихряне за 2 минути и центрофугиране при 2000 х g, долната фаза се отделя и се изпарява под поток от азот. Остатъкът се разтваря в 100 ul изопропанол-ацетонитрил (1: 9, v/v) за LC/MS 43 анализ. .

LC/MS анализ и обработка на данни

Благодаря

Тази работа е частично подкрепена от Фонда за здравни изследвания (HMRF/14-15/03), Хонконгския баптистки университет, присъжда FRG2/14-15/017, FRG2/16-17/076 и FRG2/16-17/010 на иновациите и технологиите в Хонг Конг (UIM/290) и Consun Pharmaceutical Group Limited.

Електронен допълнителен материал

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.