секретираният

  • елементи
  • абстрактно
  • целта:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • Материали и методи
  • елементи
  • Изследвания за експресия на мастна тъкан на мишка
  • Изследвания за фракциониране и експресия на човешка бяла мастна тъкан
  • Култури на първични преадипоцити
  • Генериране, култивиране и диференциация на 3T3-L1 преадипоцитни клетъчни линии
  • Изолация на РНК и количествена PCR с обратна транскрипция
  • Екстракция на протеини и Western blotting
  • Wnt-TCF4/LEF репортер тест
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • Експресията на гена SFRP1 се увеличава по време на адипогенеза при хора и мишки
  • Свръхекспресията на SFRP1 насърчава адипогенезата в 3T3-L1 преадипоцитите чрез инхибиране на Wnt/β-катенин-зависима сигнализация.
  • Sfrp1 се регулира in vivo хранителен и метаболитен статус
  • Експресия на SFRP1 в човешката мастна тъкан
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна онлайн добавка

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • диференциация
  • Метаболитен синдром
  • Затлъстяване

абстрактно

Сигнализиращата мрежа Wnt/ß-катенин предлага потенциални цели за диагностика и отделяне на затлъстяването от метаболитните му усложнения. В това проучване изследвахме ролята на антагонист на Wnt, свързан със скариди секретиран протеин 1 (SFRP1), за насърчаване на адипогенезата in vitro и разширяването на мастната тъкан in vivo.

методи:

Комбинация от човешки и миши, in vivo и in vitro модели на адипогенеза, разширяване на мастната тъкан и метаболитен синдром, свързан със затлъстяването, се използва за профилиране на участието на SFRP1.

резултатите:

SFRP1 се експресира както в миши, така и в човешки зрели адипоцити. Експресията на SFRP1 се предизвиква по време на адипогенеза in vitro и SFRP1 се предпочита да се експресира в зрели адипоцити в човешката мастна тъкан. Конститутивната ектопична експресия на SFRP1 е проадипогенна и инхибира сигналния път Wnt/β-катенин. In vivo ендогенните нива на мазнини SFRP1 се регулират в съответствие с проадипогенните условия. Въпреки това, в надлъжни проучвания на мишки с високо съдържание на мазнини, ние наблюдавахме динамично времево, но двуфазно регулиране на ендогенния SFRP1. В съответствие с този профил, ние забелязахме, че експресията на SFRP1 в човешките тъкани е най-висока при пациенти с леко затлъстяване и постепенно намалява при пациенти със затлъстяване.

заключение:

Нашите резултати показват, че SFRP1 е ендогенен модулатор на сигнализиране на Wnt/β-катенин и участва в паракринната регулация на човешката адипогенеза. Намалената експресия на мазнини на SFRP1 при болестно затлъстяване и неговият въздействащ ефект за предотвратяване на по-нататъшно разширяване на мастната тъкан може да допринесе за развитието на метаболитни усложнения при тези индивиди.

Затлъстяването е свързано с по-висок риск от развитие на хронични заболявания като сърдечно-съдови заболявания, диабет тип II, атеросклероза и така наречения метаболитен синдром. 1, 2 Въпреки подобряването на общественото съзнание, политиките за насърчаване на промените в начина на живот и научния успех в разкриване на механизми, регулиращи енергийния баланс, разпространението на затлъстяването продължава да се увеличава. Съвременните прогнози предполагат, че епидемията от затлъстяване ще бъде последвана от втора вълна от опустошителни сърдечно-съдови усложнения. Следователно, паралелно с усилията за справяне със затлъстяването, по-прагматичният подход предполага, че усилията трябва да се фокусират върху отделянето на затлъстяването от кардиометаболитни усложнения.

Въпреки че привидно противодействат на интуицията, стратегиите, които увеличават способността на мастната тъкан да съхранява липиди и следователно увеличават индивидуалното затлъстяване, могат да имат метаболитни ползи. Разрешаването на мастната тъкан да съхранява повече липиди може да предотврати вторични метаболитни усложнения, причинени от съхранение на липиди в неадипозни органи. Концепцията за благоприятно разширяване на мастната тъкан се подкрепя от очевидния парадокс, че дефицитът на мастна тъкан води до липодистрофия и това също рекапитулира много характеристики на метаболитния синдром. Като цяло е вероятно да има оптимален диапазон за общото тегло на мастната тъкан на тялото, извън който се развива метаболитна дисрегулация. Във връзка с това способността на мастната тъкан да се разширява и адаптира към нуждите от съхранение на излишък от енергия може да бъде ключов определящ фактор за податливостта към развитието на метаболитния синдром, свързан със затлъстяването. 1, 2, 3, 4 Разбирането на сигналните фактори, които контролират процеса на титрирано разширение на мастната тъкан, е основата за рационален подход при разработването на ефективни терапии за профилактика и лечение на метаболитен синдром. 5

Семейството от секретирани растежни фактори Wnt действа паракринно и/или автокринно и е известно, че контролира диференциацията на адипоцитите. 6, 7, 8, 9 Wnt сигнализирането разчита на сложна регулирана мрежа, способна да осигури контекстуален отговор в зависимост от контекста. Накратко, свързването на специфични Wnt протеини към Frizzled рецептори трансдуцира вътреклетъчни сигнали или чрез β-катенин-зависим път, или β-катенин-независими пътища. Въпреки че и двата пътя могат да бъдат активни в преадипоцитите10, той е първият, който е най-добре характеризиран и показан, че силно инхибира адипогенезата in vitro и in vivo. 8, 9 В зависимия от β-катенин път, активирането на рецептора води до стабилизиране и натрупване на цитозолен β-катенин. След това Β-катенинът се транслокира в ядрото, където се свързва и активира специфични транскрипционни фактори на лимфоидния енхансер/Т-клетъчен специфичен транскрипционен фактор (LEF/TCF). Wnt/TCF целевите гени включват циклин D1, Id2 и c-myc, които инхибират адипогенезата. 11, 12

Материали и методи

елементи

Експресия на SFRP1 по време на адипогенеза при хора и мишки. а ) Нивата на човешки SFRP1 mRNA, нормализирани до нива на 18S rRNA, бяха измерени чрез RT-PCR в реално време в посочените часове за диференциация на първични човешки (група А) SVF култури. * P ** P *** P ** P * P ** P * P ** P *** P 23 Всички протоколи за животни, използвани в това проучване, са одобрени от Министерството на вътрешните работи на Обединеното кралство и университета в Кеймбридж.

Изследвания за фракциониране и експресия на човешка бяла мастна тъкан

Изолирането на човешки адипоцити и преадипоцити се извършва върху проби, получени от субекти от група А, както е описано по-рано. 12, 23 Накратко, биопсиите на мастната тъкан се поставят във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (Sigma-Aldrich, Дорсет, Англия) и се обработват в рамките на 30 минути. Пробите бяха внимателно нарязани на кубчета и усвоени в разтвор на колагеназа (балансираният солев разтвор на Hank, съдържащ 3 mg ml-1 колагеназа тип II (Sigma-Aldrich) и 1,5% говежди серумен албумин) при 37 ° С за 1 час. Впоследствие разтворът за смилане се филтрира през мрежа от неръждаема стомана и се центрофугира при 400 g в продължение на 5 минути, за да се отделят зрелите адипоцити от стромалните съдови клетки.

Култури на първични преадипоцити

За изолиране на човешки преадипоцити се вземат проби от човешка мастна тъкан от субекти от група А. Основните преадипоцити на мишки са изолирани от епидидимална бяла мастна тъкан (WAT) на 6-седмични мъжки мишки C57B/6, както е описано по-горе. 24 Човешки и миши първични култури бяха индуцирани да се диференцират 3 дни след сливането чрез добавяне на модифицирана от Dulbecco среда на Eagle's/F12 шунка с 33 μmol 1 -1 биотин, 17 μmol -1 -1 пантотенова киселина, 10 μg ml -1 апотрансферин, 0.2 nmol l - 1 трийодтиронин, 100 nmol 1 -1 кортизол и 500 nmol 1 -1 инсулин. През първите 3 дни на култивиране към средата също се добавят 0,25 mmol 1-1-1-метил-3-изобутилксантин (IBMX). Диференциращата среда беше променена след 3 дни при първа възможност и след това на всеки 2 дни.

Генериране, култивиране и диференциация на 3T3-L1 преадипоцитни клетъчни линии

Изолация на РНК и количествена PCR с обратна транскрипция

Приготвянето на РНК, обратната транскрипция и условията на PCR в реално време за обратна транскрипция се извършват, както е описано по-горе: виж Christodoulides et al. 12 и Lagath et al. 23 за група А, Ortega et al. 21 за група В и Pietilainen et al. 22 за група С. Грундовете и сондите са закупени или от Perkin Elmer (Кеймбридж, Великобритания), или са проектирани с помощта на софтуера Primer Express (Applied Biosystems, Cheshire, UK) и последователности от базата данни GenBank.

Екстракция на протеини и Western blotting

Преди анализ на протеините чрез Western blot, средата се отстранява и клетъчните монослоеве се измиват с ледено охладен фосфатен физиологичен разтвор и след това се замразяват в течен азот. Те се размразяват върху лед и се изстъргват в лизисен буфер, както е описано по-горе при 4 ° С. Протеините се електроблотират върху нитроцелулозна мембрана (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Специфични протеини бяха открити чрез инкубация с подходящи първични антитела и конюгирани с пероксидаза от хрян вторични антитела. Имунните комплекси бяха открити чрез повишена хемилуминесценция (Amersham Biosciences).

Wnt-TCF4/LEF репортер тест

За референтния анализ на TCF4, SFRP1 клетки и празен вектор (EV) 3T3-L1 бяха отгледани до сливане и бяха проведени тестове за промотор-репортер на Topflash-reporter, както беше описано по-горе. 12

Статистически анализ

Свръхекспресията на SFRP1 насърчава адипогенезата в 3T3-L1 преадипоцитите чрез инхибиране на Wnt/β-катенин-зависима сигнализация.

SFRP1 е антагонист на сигнализирането на Wnt/β-катенин в адипоцитите на 3T3-L1. Преадипоцитите са заразени с ретровирус, носещ само човешки SFRP1 или вектор (EV). а ) Нивата на SFRP1 иРНК, нормализирани до нива на 18S рРНК, бяха измерени чрез RT-PCR в реално време на ден 0 и ден на диференциация в клетки, експресиращи SFRP1 и EV. * P *** P * P ** P *** P -1) за 48 часа. Резултатите се изразяват като кратно на разликата от EV. Резултатите се отчитат като средно ± sem от поне три независими експеримента, извършени в три екземпляра. * P ** P

SFRP1 насърчава адипогенезата в 3T3-L1 преадипоцитите. ( а ) SFRP1 и EV 3T3-L1 клетки се диференцират или не (-) при субмаксимални условия: IBMX (M) самостоятелно или дексаметазон и инсулин (DI) или с пълен диференциращ коктейл (MDI). Клетките се оцветяват с Oil Red-O, за да се визуализират липидните капчици 8 дни след индукцията. Оцветяването се определя количествено при 540 nm и се изразява като процент от EV (-). * P *** P * P ** P

Sfrp1 се регулира от хранителни сигнали, генетично затлъстяване и метаболитен статус in vivo. Нивата на Sfrpl иРНК, нормализирани до 18S рРНК, бяха измерени в ( а ) в епидидималната мастна тъкан и ( б ) зрели адипоцити от 8-седмични мъжки мишки C57/B16, които са били стимулирани при следните условия: хранени (n = 8-9), гладували (24 часа) (n = 7-8) и гладували (24 часа) (п = 7–8). * P ** P *** P ** P *** P * P 23 По-важното е, че това увеличение на разтегливостта на мастната тъкан е свързано със значително повишени нива на Sfrp1 (Фигура 4f).

Като цяло тези наблюдения предполагат, че in vivo нивата на иРНК на WAT Sfrp1 са повишени, когато има нужда от съхранение на мазнини и разширяване на мастната тъкан; констатация, съответстваща на неговата роля in vitro за насърчаване на набирането и узряването на нови адипоцити. Това увеличение на Sfrp1 обаче не изглежда устойчиво, въпреки поддържането на положителен калориен баланс и търсенето на мазнини. Това предполага, че SFRP1 може да бъде полезен маркер и подкрепя съществуването на горна физиологична граница, в рамките на която мастните запаси могат да се разширяват и натрупват липиди. Интересното е, че намаляването на нивата на Sfrp1 след 6 месеца HFD е свързано с развитието на метаболитни усложнения.

Експресия на SFRP1 в човешката мастна тъкан

Регулиране на SFRP1 в човешката мастна тъкан. а ) SFRP1 нива на иРНК, нормализирани до циклофилин А, в подкожната мастна тъкан на 31 бели европейски жени (група В). За всички субекти границата на ИТМ се определя съгласно класификацията на СЗО (BMI 40, n = 12). Дисперсионният анализ (ANOVA) не достига статистическа значимост, P = 0, 059. ( б ) Експресията на SFRP1 Microarray е измерена в подкожна мастна тъкан от 13 двойки монозиготни близнаци, несъгласни по тегло (група С). Сдвоен t-тест, ** P = 0,005.

Изображение в пълен размер

дискусия

Нашата група, заедно с други, преди това е показала, че сигналната пътека Wnt/β-катенин може да регулира адипогенезата in vitro и in vivo (прегледано в Prestwich and Macdougald 8 и Christodoulides et al. 9). Много от тези проучвания са фокусирани върху генетичната и/или фармакологична манипулация на Wnt/β-катенин сигнални компоненти в миши модели. Наскоро обаче се опитахме да разширим това изследване, за да разберем по-добре ролята на ендогенното Wnt сигнализиране в пластичността на мастната тъкан при гризачи и хора. Наскоро въведохме хранително регулирания преадипоцитен ген Dact1, който насърчава адипогенезата чрез координирани ефекти върху генната експресия. Това води до селективна промяна както на вътреклетъчните, така и на паракринните/автокринните компоненти на сигналния път Wnt/β-катенин. 23 Освен това експресията и активността на сигналната мрежа Wnt/β-катенин изглежда зависи от контекста и видовете, наистина някои компоненти, като Dkk1, изглежда се експресират в човешката мастна тъкан, но не и в модели на мишки. 12

Тук показваме, че SFRP1 може също да бъде важен извънклетъчен модулатор на сигнализация на Wnt/β-катенин и сам по себе си се регулира по време на адипогенеза и затлъстяване. Ние показахме, че SFRP1 се регулира динамично по време на адипогенеза както при хора, така и при мишки, а също така насърчава диференциацията на адипоцитите in vitro. Проадипогенната роля на SFRP1 е в съответствие с намаленото затлъстяване на мишки с нулев SFRP1. По-важното е, че ние също така предоставяме доказателства, че ендогенният SFRP1 е силно регулиран в отговор на многократно приложение и краткосрочно HFD in vivo в WAT. Това прави SFRP1 силен кандидат, който допринася за титрираната реакция на мастната тъкан към краткосрочни хранителни предизвикателства. Нашите данни обаче също подкрепят схващането, че същата хомеостатична система, която регулира разширяването и функционирането на мастната тъкан, е ограничена и може да доведе до хроничен хранителен излишък, установен при болестно затлъстяване. В допълнение към установената граница на масата на мастната тъкан, капацитетът за по-нататъшно разширяване на мастната тъкан се изчерпва, което според нас води до метаболитни усложнения, свързани със затлъстяването.

Въпреки добре установената роля за сигнализиране на Wnt/β-катенин по време на in vitro и in vivo адипогенеза, важен аспект, който остава по-слабо характеризиран, е дали същите сигнали играят роля при регулирането на масата на човешката мастна тъкан. Ние показваме, че ендогенният SFRP1 също се регулира в човешката мастна тъкан и че той се експресира предимно в адипоцитите. Нашите проучвания на напречно сечение допълнително предполагат, че експресията на SFRP1 може да има двуфазен профил в човешката мастна тъкан, подобен на този, наблюдаван при гризачи. По-специално, експресията на човешки мастен SFRP1 се увеличава при индивиди с леко затлъстяване (ИТМ между 25 kg m-2 и 30 kg m-2) и след това постепенно намалява по време на развитието към болестно затлъстяване. Ясно е, че пълното валидиране на този модел при хора ще изисква проспективно проучване, което в момента не е осъществимо.

При затлъстели инсулиноустойчиви състояния се появява локализирано възпаление на мастната тъкан, което може да помогне за ограничаване на по-нататъшното разширяване на мастната тъкан. Всъщност ние и други показахме, че противовъзпалителните цитокини, открити в резистентни на инсулин състояния, могат да нарушат адипогенезата, като се сближават с сигнализиране на Wnt/β-катенин. 11, 26 Има данни и за намален адипогенен капацитет при затлъстяването при хора. 27, 28, 29 Повишените възпалителни цитокини, открити при инсулинорезистентни условия на затлъстяване, могат да дадат обяснение за намалените нива на SFRP1, открити при мишки C57B16, хранени с HFD в продължение на 6 месеца. За да се потвърди тази връзка в човешкия WAT, би било необходимо да има достъп до мастна тъкан от пациенти със силно затлъстяване с нелекуван и/или неконтролиран диабет. Това обаче не изключва възможността привидно "нормалните" нива на SFRP1, наблюдавани при болестно затлъстяване, да се считат за непропорционално ниски по отношение на степента на мастна експанзия на тези индивиди. В тази връзка тези неподходящи нива на SFRP1 могат да отразяват биологичната граница, до която тези индивиди могат да разширят запасите си от мазнини.

Предполагаемата роля на SFRP1 в пластичността на мастната тъкан.

Изображение в пълен размер

В обобщение, идентифицирахме и характеризирахме ролята на SFRP1, секретиран инхибитор на Wnt сигнализиране, като определящ фактор за разтегливостта на мастната тъкан. Бъдещите проучвания с използване на по-големи кохорти могат да предоставят доказателства за неговата полезност като индикатор за риска от метаболитни усложнения, свързани със затлъстяването. Заедно нашите данни подкрепят концепцията за максимален капацитет за разширяване на мастната тъкан и допълнително предполагат сигнализиране на Wnt като важен модулатор на разтегливостта на мастната тъкан с потенциална терапевтична употреба при лечението на метаболитни усложнения, свързани със затлъстяването.