абстрактно
Размножаването, разпространението и заселването са основни популационни процеси и са критични етапи от жизнения цикъл на организма. При симбиотичните организми, като лишеи, състоящи се от гъби и популации от фотобионти, размножаването е сложен процес. Въпреки че много лишеи са способни да се размножават както по полов, така и по безполов начин, степента на вегетативно размножаване в местните популации е неизвестна. Използвахме шест полиморфни микросателитни локуса, за да определим дали рекомбинацията е често срещана в естествените популации и дали и как клоновото размножаване влияе върху пространствената генетична структура в популациите от епифитни лишеи от Lobaria pulmonaria. Високото генетично разнообразие във всички 12 изследвани популации и доказателства за рекомбинация от различни тестове показаха, че L. pulmonaria е предимно отстъпващ вид. Въпреки това, клоналността настъпи във всички популации, но наличието на повтарящи се многоблокови генотипове засегна пространствената генетична структура само при популации с ниска плътност. Това може да се тълкува като показател за генетични затруднения поради увеличената загуба на местообитания и нарушения. В резултат на това за преобладаващо лишайни видове, пресичащи екзогенни фактори, могат значително да повлияят на популационните процеси и по този начин генетичната структура.
Промоцията, независимо дали е сексуална или безполова, е основна стъпка в жизнения цикъл на всеки отделен организъм. Сексуалното размножаване увеличава броя на различните генотипове в популациите и увеличава вероятността за оцеляване в конкурентна и/или променяща се среда (Maynard Smith, 1978; Balloux et al., 2000), докато безполовото разпространение може да бъде успешна стратегия за развитие на добре адаптирани генотипове.в екстремни, но стабилни местообитания (Murtagh et al, 2000). Докато познанията ни за системите и моделите на чифтосване при животни и растения са широки (напр. Jackson et al., 1996; Takebayashi and Morrell, 2001), ние едва сме започнали да ги изследваме и разбираме в симбиотични форми на живот като лишеи. Въпреки няколко проучвания върху сексуалното размножаване при лишеи (Murtagh et al., 2000; Kroken and Taylor, 2001; Högberg et al., 2002), нищо не се знае за неговото значение в сравнение с клоналната репродукция (чрез фрагменти от талус, соредия или исидия) в естествени популации. Следователно целите на това проучване бяха (i) да се изследва дали рекомбинацията и по този начин размножаването е често срещано в естествените популации лишеи и (ii) да се определи как клоновото размножаване влияе върху пространствената генетична структура в популациите.
Материали и методи
Фолиос епифитен лишей L. pulmonaria (L.) Hoffm. широко разпространен е в околните райони на Северното полукълбо и в Южна Африка (Yoshimura, 1971, 1998a, 1998b). Докато L. pulmonaria е широко разпространен и все още често срещан в Северна Америка (Brodo et al, 2001), той се счита за застрашен в много части на Европа (Wirth et al., 1996). Въпреки че е описан като сексуално и клонално размножаващ се вид, апокасите (плодови тела със сексуални пропагули) често се формират и популациите само с ограничен брой гъбични генотипове изглеждат несексуални (Zoller et al, 1999). Тази корелация между генотипното разнообразие и плодовитостта е интерпретирана като доказателство, че L. pulmonaria може да е самостерилна (хетеротална; Zoller et al., 1999).
Вземане на проби
Общо 562 талк L. pulmonaria са събрани от девет популации в Британска Колумбия, Канада и три популации в Швейцария (Таблица 1). Смятахме популацията като петно от дървета, колонизирани с L. pulmonaria. Зад периметъра на пластира този вид не присъства на местно ниво. Проби от Британска Колумбия бяха събрани в три различни зони (хипермари време, военноморски и интермонтан; Goward, 1999), за да мигрират от южния бряг на остров Ванкувър във вътрешността на провинцията. Тези популации се срещат или в старите гори (напр. CS, PR, DC, CL, BL или OC) или в гъсти необезпокоявани гори (AY, TO и BC). Проби от Швейцария бяха събрани в относително големи, но слабо населени популации в Преалпите и планините Юра, където антропогенните смущения бяха минимални. В цялата популация от избрани най-близки съседни дървета на случаен принцип са взети по един тали на дърво. Измерва се разстоянието между гостоприемните дървета, изчислява се площта на местното население (Таблица 2) и се определя броят на пробите с апотеция.
Маса в пълен размер
Маса в пълен размер
Микросателитен анализ
ДНК е изолирана съгласно Walser et al. (2003) от приблизително 20 mg пречистени маргинални лобове на талус. Изследвани са шест микросателитни локуса (LPu03, LPu09, LPu15, LPu16, LPu20 и LPu27; Walser et al., 2003) и четири от оригиналните праймери са преработени, за да се съкратят размерите на алелите или да се избегнат инделите в фланкиращите региони. (Таблица 3). Сайтовете бяха амплифицирани в две мултиплексни полимеразни верижни реакции (PCR), всяка съдържаща три двойки праймери (LPu03/LPu09/LPu15 и LPu16/LPu20/LPu27). Последващо усилване и анализ на фрагменти с помощта на автоматизиран капилярен секвенсор следват протоколите, докладвани от Walser et al. (2003). Тъй като ДНК е изолирана от материал на талуса, делът на гъбичната ДНК е неизвестен и варира между пробите. 3 μl екстракт от геномна ДНК се използва във всяка 30 μl реакция на амплификация. В допълнение към Walser et al. (2003), дължините на 19 алела в локуса LPu09, които бяха по-дълги от 400 bp, бяха частично проверени за стандартен размер ROX-1000 (Applied Biosystems) и впоследствие екстраполирани. Извадени бяха проби с липсващи данни от микросателит (n = 3).
Маса в пълен размер
Статистически анализ
Средният брой алели (A) и средният ефективен брой алели (Ae) са изчислени според Hartl and Clark (1997).
Тъй като гъбичният партньор на лишеи е хаплоиден и има само един алел на локус, рекомбинационните тестове включват изследване на алелни асоциации между различни локуси (Maynard Smith et al., 1993). Панмиксия би означавало, че алелите във всички локуси, с изключение на физически близки локуси, са случайно свързани помежду си. Въпреки това, дори гените на различни хромозоми могат да се отклоняват от произволна асоциация поради различни фактори като генетичен дрейф, селекция, клонална репродукция и/или неподходящо чифтосване (Lewontin, 1988). Използвахме анализа χ 2 с P-стойности, изчислени от пермутации на Монте Карло с 10 000 реплики и модифицирани по метода на Hommel за множество сравнения (Hommel, 1988), за да тестваме за наличието на значителна връзка между двойките локуси на популация (с а. Също така изчислихме нормализираната мярка на общия дисбаланс, описана от Hedrick (1987) и разширения тест за вероятностна вероятност на Fisher под нулевата хипотеза, че няма връзка между двата тествани локуса на популация, както е приложено в ARLEQUIN (Schneider et al, 2000).
Също така използвахме стандартизиран индекс за асоцииране (IA) (Maynard Smith et al., 1993), за да контролираме рекомбинацията или клоналността в популациите. Наблюдаваното отклонение (VD) се изчислява от разпределението на стойностите на несъответствие и се сравнява с очакваното отклонение (Ve) при равновесно свързване (Maynard Smith et al., 1993; Haubold et al., 1998; Haubold and Hudson, 2000) . Нулевата хипотеза (I A = 0, т.е. произволна асоциация на алели) беше тествана с 1000 пермутации и Р-стойностите бяха коригирани отново по метода на Hommel (1988). Тези изчисления са извършени веднъж и веднъж без повтарящи се генотипове.
Ако гъбичките, образуващи лишеи, се възпроизвеждат клонално (чрез митоза) или чрез хомотално чифтосване, целият геном е ефективно свързан, тъй като няма сегрегация и няма повторно сортиране на алели. В допълнение, ние изчислихме двойни сравнения на микросателитни локуси в допълнение към описаните по-горе мултилокусни асоциации. Липсата на асоциация между която и да е двойка локуси може да се интерпретира като последица от рекомбинацията, докато свързването или хомоплазията могат да причинят отклонения от очакваните генотипични честоти при случайно сдвояване при някои двойки локуси.
Пространствената генетична структура в популациите беше анализирана въз основа на многолокусни генотипове (Smouse и Peakall, 1999), използвайки GENALEX (Peakall и Smouse, 2001), за да се изследват разсейващите ефекти на вегетативните и сексуалните пропагули. Проведохме теста за пространствена автокорелация за клас разстояния с еднакви размери на пробата и използвахме последователен модел на мутация, базиран на разликите между двата генотипа (Slatkin, 1995), който се основава на разликите в сумата между двата генотипа (Slatkin, 1995 ). Анализът на пространствената автокорелация е извършен два пъти: веднъж и веднъж без повтарящи се генотипове. Отклонението от нулевата хипотеза H 0: r = 0 беше определено чрез 1000 пермутации. В допълнение към този анализ, тествахме и корелацията между географските и генетичните разстояния в популациите на L. pulmonaria, използвайки тестове на Mantel с 1000 пермутации, изчислени с R пакета.
Коефициентите на корелация на корелация на Спирман бяха използвани за оценка на връзката между местната популационна площ (трансформирана в логарифми) и процента на различни генотипове (M) или плодови проби и между процента на плодородните проби и средния брой алели (A) или средното ефективно число на алела (Ae).
резултатът
Микросателитно разнообразие и честота на апотеция
Генетичното разнообразие в местните популации на L. pulmonaria, основано на шест микросателитни локуса, беше високо. От 562 анализирани индивида открихме 405 различни генотипа, от които 75% са се появили само веднъж. Броят на алелите на локус и популация варира от един за локуса LPu27 в DC популацията до 22 за локуса LPu20 в популацията BC. Средният брой алели на популация (A) варира от 5, 3 до 10, 5, а средният ефективен брой алели (Ae) варира от 3, 1 до 5, 7 (Таблица 2). Процентите на различните генотипове (М) са еднакво ниски в популациите на Швейцария (
50%), но варира от 52 до 92% сред населението на Британска Колумбия (Таблица 2). Процентите на плодородните проби (носещи апотеция) варират от 0% (ултразвукова популация) до максимум 42% (CS и PR популации; Таблица 2). Имаше значителна отрицателна връзка между М и местното население (коефициент на Спирман, r s =, 0, 766, P = 0.005). За разлика от това не открихме значителна корелация между процента на плодородните проби (апотеция) и средния брой алели (A) или средния ефективен брой алели (A e) или между процента на плодородните проби и местното население.
Рекомбинация и клоналност
И трите измервания за обвързване на дисбаланса, тестът χ2, нормализираното измерване на общия дисбаланс на Хедрик и разширеният тест за вероятност на Fisher разширяват резултатите. Дадени са само резултатите от χ 2 теста (Таблица 4). Около 5% от всички двойни сравнения в Британска Колумбия и 7% в Швейцария отхвърлиха нулевата хипотеза за независимост на локусите. Резултатите не съответстват на локусите и предполагат свързващ дисбаланс между локусите LPu 16/LPu 27 и LPu 20/LPu 27 (Таблица 4).
Маса в пълен размер
В анализа на сдвоения и мултилокусен асоциационен индекс IA (Maynard Smith et al., 1993) и когато всички проби бяха разгледани, нулевата хипотеза (т.е. няма връзка между двата локуса) беше отхвърлена при 32 и 69% от всички двойни сравнения в Британска Колумбия и Швейцария (Таблица 5а). С изключение на повтарящите се генотипове, нулевата хипотеза беше отхвърлена само при двойни сравнения за 5% за Британска Колумбия и 4% за Швейцария (Таблица 5б). В съответствие с горния анализ на неравновесните връзки, малко по-високата стойност на стойностите на IA се различава значително от нулата за локусите LPu 16, LPu 20 и LPu 27 (Таблица 5b).
Маса в пълен размер
Пространствена генетична структура
Анализът на пространствената автокорелация показва различни генетични структури в популациите на Швейцария и Британска Колумбия L. pulmonaria. В швейцарските популации положителните автокорелационни стойности (r) бяха открити в първите класове на разстояние, когато всички анализи (с повтарящи се генотипове) бяха използвани в анализа (Фигура 1). В популацията на МТ е установен особено висок коефициент r> 0,6 на най-краткото разстояние. Тази положителна автокорелация обаче в швейцарските популации изчезва, когато повтарящи се генотипове са изключени от анализа (Фигура 1). За разлика от това, ние не открихме значима генетична структура в нито една от деветте популации на L. pulmonaria в Британска Колумбия, независимо дали се разглеждат повтарящи се генотипове. Като пример, съответните корграми за популацията TO са показани на ФИГ.
Примери за многолокусна пространствена автокорелация в Lobaria pulmonaria; популации от Швейцария (TW, MT и UZ) и Британска Колумбия в Канада (TO). За всяка популация са показани две корелограми със и без повтарящи се генотипове. 95% доверителни интервали са обозначени с пунктирани линии, а стойностите, значително различни от нула (на базата на 1000 пермутации), са обозначени със звездичка. Обърнете внимание на различните скали на оста x по отношение на един и същ размер на пробата в рамките на класовете на разстояние, но следователно различни скали на популация.
Изображение в пълен размер
В съответствие с тези резултати са установени значими и положителни корелации на Мантел само между географските и генетичните разстояния на популациите на Швейцария, когато са включени всички проби (данните не са показани). Корелациите обаче не са значими, когато се използва намален набор от данни без повтарящи се генотипове.
дискусия
рекомбинация
Като цяло популациите от Швейцария имат по-ниска плътност на тала от популациите от Британска Колумбия и биха могли да представляват остатъците от по-големи, по-плътни и плодородни популации. В допълнение, връзката между плодородните проби и степента на генетичното разнообразие се влияе от целогодишния жизнен цикъл на лишеите и от факта, че апотецията при L. pulmonaria се появява на по-късни етапи от живота (Ramstad и Hestmark, 2001; Denison, 2003 ). Следователно е възможно различните възрастови структури в изследваните популации да доведат до разлики в наблюдаваната честота на апотеция. Данните в таблица 2 обаче показват, че процентът на плодови проби на население може да варира между Швейцария и Британска Колумбия или дори между зоните в Британска Колумбия. Тези открития предполагат, че честотата и развитието на апотеция се управляват от екзогенни фактори, като океана, който обаче е объркан в нашето изследване от височината.
Генетична структура
Неотдавнашно проучване на летаргия vulpina показа, че пробите от Северна Америка имат по-високи генетични вариации в осем единични нуклеотидни полиморфни места (SNP), отколкото проби от Швеция или Италия. Поради това беше направено заключението, че L. vulpina трябва да бъде зачеркната в Северна Америка, но ефективно клонална в Европа (Högberg et al, 2002). По същия начин, нашите данни показват, че популациите на L. pulmonaria от Британска Колумбия също имат значително повече генотипове от швейцарските популации (Таблица 2). Това по-ниско генотипно разнообразие в популациите на Швейцария може да се отдаде на историческите тесни места (Zoller et al, 1999). Освен това установихме също, че популациите на остров Ванкувър, с изключение на популацията CL, имат по-ниско генотипно разнообразие от популациите на континента. Това може да се дължи на пространствената изолация на тези популации (Walser et al., Непубликувани данни). Интересното е, че броят на различните генотипове показва отрицателна връзка с местното население, което може да означава, че по-плътните популации поддържат по-голям брой генотипове.
В допълнение, нашите данни сочат за значително дребно клоново разпространение в трите швейцарски популации (Walser, в пресата). Различните пространствени генетични структури между популациите на два континента могат да се отдадат на плътността на популацията и историята. Например популациите от Британска Колумбия се срещат в по-малко нарушени горски екосистеми в сравнение с швейцарските популации, което може да е довело до по-голяма местна плътност, припокриващи се поколения и повече генотипове, дори в малка площ. Интересното е, че Gu et al. (2001) установяват, че пространствените модели на L. pulmonaria във Финландия са по-контролирани, отколкото в девствените гори. Въпреки че те не са изследвали пространствената генетична структура, техните резултати, заедно с нашите резултати, предполагат, че историята на популацията може да повлияе на пространствените модели в една популация.
заключения
Благодаря
Благодаря на Тревър Гоуърд и Анди Макинън за настаняването им, оживената дискусия и полевата помощ. Благодарни сме също на Phil LePage, David Cuzner и Trace Leys-Schirok от Службата за горите на Британска Колумбия за подкрепата. Длъжни сме на Сюзън Е Хойби, двама рецензенти и редактор, за техните конструктивни коментари по ръкописа. Това изследване е финансирано от Швейцарската национална научна фондация (SNF 31-59241.99) и е свързано с Програмата за изследване на оцеляването на растенията NCCR, PS6.