елементи

абстрактно

Диабетът тип 2 е хронично метаболитно разстройство, което се причинява главно от инсулинова резистентност, чийто основен фактор е затлъстяването. Експресионните нива на GPR21, свързани с протеинови рецептори (GPCR), демонстрираха тенденция към значително увеличаване на епидидималните мастни накладки при мишки с високо съдържание на мазнини и високо съдържание на мазнини (HFHS). За да се получи по-нататъшна представа за потенциалната роля, която тази нова цел може да играе за развитието на диабет тип 2, свързан със затлъстяването, са проучени възможностите за рецепторна сигнализация. Изследванията на свръхекспресията в клетки HEK293T показват, че GPR21 е конститутивно активен рецептор, който се свързва с G qq протеини от тип G, което води до активиране на митоген-активирани протеинкинази (MAPK). Свръхекспресията на GPR21 in vitro също значително отслабва инсулиновата сигнализация. Интересното е, че ефектът на GPR21 върху MAPK и инсулиновата сигнализация е намален в присъствието на серум, което води до възможността за естествен инхибиторен лиганд. Изследванията на хомоложно моделиране и докинг на лиганди доведоха до идентифицирането на ново съединение, което инхибира активността на GPR21. Неговите ефекти предлагат потенциал като антидиабетна фармакологична стратегия, тъй като е доказано, че противодейства на ефекта на GPR21 върху инсулиновия сигнален път.

Диабетът тип 2 се причинява главно от инсулиноустойчиво системно състояние, причинено от увеличаване на вискозната мастна тъкан, което отключва хронично, нискостепенно възпаление, което се отразява неблагоприятно на инсулиновия сигнален път 1, 2. Нарастващата честота на диабет тип 2, заедно с ограниченията на настоящите режими на лечение, налага иновативни, ефективни стратегии за предотвратяване на развитието и прогресирането на това заболяване. G-протеиновите рецептори (GPCRs), най-голямото протеиново суперсемейство в генома, са богат източник на лекарствени цели, тъй като лесно предават външни сигнали към вътрешната среда на клетката: приблизително 30-40% от предлаганите на пазара лекарства са насочени към тези универсални рецептори 3 .

Наблюдавахме повишаване на нивата на експресия на GPCR, GPR21, в мастната тъкан на мишки с висока захар (HFHS). Въпреки че това увеличение не достига статистически значимо ниво, GPR21 може да представлява ново средство, чрез което целевият фенотип тип 2 може да бъде насочен, тъй като този GPCR е проектиран да се сдвоява с G q q подтип G протеини, Gaq10 и Ga15/16 11. Напредъкът в моделирането на хомология и проучванията за докинг на лиганди значително улесни разработването на целенасочени терапии за осиротели GPCR 12. Тъй като структурата на GPR21 остава неизвестна, тези техники са използвани за идентифициране на потенциални малки молекули, способни да свързват и регулират ефектите на този рецептор.

Тази работа предоставя анализ на индуцирана от GPR21 сигнална трансдукция, която предоставя преглед на механизмите, чрез които този рецептор може да действа върху диабетичния фенотип тип 2 и по този начин може да представлява възможност за нова терапевтична стратегия. Наблюдаваната конститутивна активност на GPR21, която насърчава активирането на MAPK и влияе неблагоприятно на инсулиновия сигнальен път, може да се регулира от естествения лиганд, присъстващ в серума. Освен това е установено, че ново съединение, предназначено да се свързва с GPR21, предпазва от наблюдаваните ефекти на рецептора върху инсулиновия сигнален път.

резултатът

GPR21 е конститутивно активна рецепторна сигнализация чрез Ga15/16

регулиране

Епидидимални мастни подложки от контролни и HFHS-хранени мишки C57BL/6J бяха лизирани, протеини разделени чрез SDS-PAGE и експресия ( а ) GPR21 a ( б ) на маркер за макрофаги, F4/80, оценен чрез Western blot. Представени са представителни Western blots заедно с относителната плътност, определена с помощта на софтуера Image J, представена като средна стойност ± SEM, n = 9. Значително увеличение на експресията на F4/80 се наблюдава от несдвоения t-тест на Student при p

Изображение в пълен размер

Тъй като свръхекспресията на GPR21 причинява значително увеличаване на JNK фосфорилирането, се оценява ефекта на рецептора върху инсулиновия сигнен път. Клетките HEK293T, свръхекспресиращи GPR21, не реагират на индуцирана от инсулин стимулация на техния рецептор, резултат, който леко намалява в присъствието на серум (фиг. 2д). Надолу по пътя на GPR21 свръхекспресията предотвратява фосфорилирането на IRS1, Akt и AS160 в присъствието и отсъствието на инсулин. Този резултат отново беше намален, когато клетките бяха инкубирани със серум-съдържаща среда. Сроден резултат се наблюдава, когато GPR21 се свързва с Ga 15/16 (фиг. 2е), въпреки че ефектът от серума е лек. Поради атенюирания път на сигнализиране за инсулин, GPR21 също причинява значително намаляване на усвояването на глюкоза, което е частично изолирано в присъствието на серум (фиг. 2g). При съвместна експресия с G15 15/16 се наблюдава подобна тенденция (фиг. 2з). Ефектът на GPR21 върху инсулиновия сигнален път не се ограничава до HEK293T клетки, тъй като този ефект може да се наблюдава и в СНО клетки, свръхекспресиращи рецептора (вж. Допълнителна фигура S1).

Новото съединение предпазва от ефектите на GPR21

Тази работа демонстрира потенциалната роля, която GPR21 може да играе в развитието на диабет тип 2 (фиг. 4). Индуцираният от затлъстяването диабет тип 2 може да бъде свързан с дисрегулация на GPR21 чрез повишена рецепторна експресия, повишен ендогенен агонист или намален обратен агонист, което води до стимулиране на MAPK, които допринасят за инхибиторните ефекти на GPR21. Насочването на GPR21 с обратен агонист, като този, идентифициран в това проучване, може да ограничи някои от многото аспекти, допринасящи за развитието на инсулинова резистентност и диабет тип 2.

Съставно активен GPR21 придобива и активира G15 15/16, което улеснява хидролизата на PIP 2 до DAG и IP3 чрез PLC. И DAG, и IP 3 активират PKC, който сигнализира и активира MAPK каскадата. MAPK JNK играе ключова роля в развитието на инсулинова резистентност, тъй като насърчава фосфорилирането на ключов компонент на инсулиновата сигнална каскада, IRS1, в Ser 307, като по този начин предотвратява индуцираното от инсулин фосфорилиране на тирозин. Индуцираното от GPR21 активиране на MAPK може да допринесе за развитието на диабет тип 2. Поради потенциала на естествения обратен агонист в серума, се смята, че трансдукцията на сигнала GPR21 е строго регулирана при нормални физиологични условия. При затлъстяване обаче повишената активност на GPR21 може да стане вредна, потенциално насърчавайки развитието на инсулинова резистентност.

Изображение в пълен размер

методи

Мъжки мишки C57BL/6J на 4-седмична възраст (n = 18, предоставени от Charles River, Calco, Lecco, Италия) бяха настанени в контролирана от околната среда среда с 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Животните се поддържат на диета с гранули в продължение на 1 седмица, след което на случаен принцип се разделят на две групи: нормална диета (контрол, n = 9) и диета с високо съдържание на захар и високо съдържание на захар (HFHS, n = 9) за 16 седмици. Диетата HFHS съдържа 45% kcal мазнини, 35% kcal въглехидрати и 20% kcal протеин (D12451, ssniff Spezialdiäten GmbH, Германия). Процедурите, използвани в това проучване, са одобрени от Комитета за употреба и грижи за животните към Университета в Торино и впоследствие от Комитета по етика на Националния университет на Ирландия, Maynooth (BSRESC-2014-008). Протоколите бяха в съответствие с Европейската директива 2010/63/ЕС за защита на животните, използвани за научни цели.

Клетъчна култура, трансфекция и лечение

Клетките HEK293T се поддържат в пълна среда (модифицирана от Dulbecco модифицирана среда на Eagle с висока глюкоза (DMEM), съдържаща 2 mM L-глутамин и 100 ug/ml пеницилин-стрептомицин), допълнена с 10% (v/v) фетален говежди серум (FBS) (Sigma) при 37 ° C във влажна атмосфера от 5% CO 2. Клетките бяха трансфектирани с 2 μg човешки GPR21, съдържащ myc етикет, включен в С-края или празен вектор, pCMV6-Entry (OriGene Technologies), с Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) съгласно протоколите на производителя. При ко-трансфекция с cDNA, съответстваща на α-субединиците на G-протеин, Gaq, Ga15/16 и Ga14 (cDNA Resource Center), бяха използвани 1 μg от всеки плазмид. Клетките се инкубират в продължение на 24 часа при 37 ° С, за да се позволи включване на плазмидна ДНК. За да се определи ефектът на серума върху активността на GPR21, клетките се инкубират за допълнителни 24 часа с прясна пълна среда ± 10% (v/v) FBS. Лечението със съединения (GF109203X, U73122 и SP600125, Sigma) се извършва в пълна среда без серум. За да се определи ефектът от GPR21 върху инсулиновата сигнализация, HEK293T клетките се стимулират със 100 nM инсулин (Sigma) в буфера на Kreb's Ringer (KRB); 136 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4.7 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl 2, 4.0 mM Na2 HPO 4, 0.95 mM NaH 2 PO 4, pH 7.4, съдържащ 5 mM глюкоза за 1 час при 37 ° C,

Инозитол фосфат (IP-one) хомогенно време на флуоресценция (HTRF)

Клетъчните нива на IP 1 бяха измерени с помощта на HTRF IP-one assay kit (Cisbio) 13. Накратко, субконфлюентните клетки бяха отделени от съда за клетъчна култура чрез трипсинизация и ресуспендирани в подходящ обем на буфер за стимулиране на анализа (10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 4.2 mM KCl, 146 mM NaCl, 5.5 mM глюкоза) . 50 mM LiCl, рН 7.4) се нагрява до 37 ° С до концентрация 6 х 106 клетки/ml. Клетъчната суспензия се добавя към бяла плака с половин обем 384 гнезда (Greiner) заедно с тестваното съединение и се инкубира при 37 ° С в продължение на 2 часа. IP-one лизисен буфер, съдържащ 5% IP-one-d2 конюгат се добавя към подходящите ямки, последван от 5% анти-IP-one Tb криптат конюгат. Пробите се инкубират на тъмно в продължение на 1 час при стайна температура. Плочата беше отчетена върху BMG лабораторна плака с плаки, възбудени при 340 nm и излъчени при 615 nm и 665 nm. Съотношенията на флуоресцентния резонансен енергиен трансфер (FRET) (665 nm/615 nm) бяха преобразувани в концентрации IP 1 чрез интерполиране на стойности от стандартната крива IP 1. .

Приготвяне на лизати и Western blot анализ

Замразени миши епидидимни мастни подложки се хомогенизират в ледено студен лизисен буфер (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EGTA, 1,5 mM MgCl 2, 2 mM Na 3 VO 4, 10% (v/v ). об.) глицерол, mM Na 4 P 2 O 7, 1 mM PMSF, 1X коктейл от инхибитор на SigmaFAST протеаза и 1% (v/v) Triton x-100) в съотношение 1: 5 (w: v) с помощта на ръчен T10 Basic хомогенизатор (IKA). Клетките се промиват три пъти с ледено охладен с фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS), след което се суспендират отново в лизисен буфер. Суровите екстракти се инкубират в продължение на 1 час при 4 ° С при разбъркване. Пробите се центрофугират при 17 000 х g в продължение на 10 минути при 4 ° С, неразтворимите пелети се отстраняват и концентрацията на протеин се определя с помощта на теста на Пиърс протеин (PN22660).

Лизатите със същата протеинова концентрация се разделят чрез SDS-PAGE, прехвърлят се в PVDF мембрана и се блокират за 1 час в Tris-буфериран физиологичен разтвор (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, рН 7,6) с 0,1% (v/v) Tween -20, съдържащ 5% (w/v) говежди серумен албумин (BSA). Мембраните се инкубират с първични антитела за една нощ при 4 ° С, последвани от конюгирани с пероксидаза от хрян вторични антитела за 2 часа при стайна температура. Протеиновите ленти се визуализират върху рентгенов филм с повишена хемилуминесценция (Roche). Имунодетекцията е постигната с помощта на следните антитела от Cell Signaling Technology; фосфо-ПКС Thr 505 (9374), фосфо-Erk Thr 202/Tyr 204 (4370), Erk (4695), фосфо-p38 Thr 180/Tyr 182 (4511), p38 (9212), фосфо-JNK Thr 183/Tyr 185 (4668), JNK (9258), фосфо-инсулинов рецептор p Tyr 1150/1151 (3024), IRS1 (3407), phospho-Akt Ser 473 (9271), Akt (9272), phospho-AS160 Thr 642 (8881), phospho-AS160 Ser 588 (8730), AS160 (2670) и myc (2276). Phospho-IRS1 Tyr 612 (44-816G) се доставя от Life Technologies и инсулиновите рецептори β (ab69508), GPR21 (ab139654), F4/80 (ab74383) и β-актин (ab8226) са закупени от Abcam.

Поглъщане на 2-дезоксиглюкоза

Поглъщането на глюкоза беше измерено съгласно Yun et al.18, с модификации. Трансфектираните клетки HEK293T се измиват веднъж с KRB, нагрята до 37 ° С, след което се инкубират с 1 μCi/ml [3Н] -2-деоксиглюкоза (PerkinElmer, NET328A001MC), приготвена в KRB при 37 ° С за 10 минути. За завършване на анализа клетките се измиват три пъти с ледено студен KRB и се лизират в 0.1% (w/v) SDS при 37 ° С за 30 минути. Клетъчните лизати се разреждат 1: 4 в β-сцинтилационна течност (Beta-Plate Scint, PerkinElmer). Включването на [3Н] -2-деоксиглюкоза се определя количествено с помощта на течен сцинтилационен брояч Wallac 1450 Microbeta (PerkinElmer), изразяващ резултати в броя на минута (CPM). Общото съдържание на протеин се определя чрез процедурата с бицинхонинова киселина 19, за да се определят резултатите като CPM/mg.

Моделиране и докинг на хомоложен лиганд GPR21

Вътрешният структурен модел GPR21 е конструиран с помощта на софтуера Modeller, вграден в Biovia Discovery Studio 20. Извършени са сравнения на последователности между аминокиселинната последователност на шаблоните за GPCR (2RH1 21, 4GBR 22) с hGPR21 (Swissprot код за присъединяване Q99679) и ръчно проверени, за да се потвърди правилното подравняване на запазените остатъци 23. Използвайки подравняването, бяха създадени 1000 различни модела с последващ протокол за усъвършенстване, приложен към зоните на контури 24, 25. Дисулфидните връзки се образуват между Cys 102 и Cys181. Крайният модел беше избран с помощта на обективния резултат на Modeller и селекция от инструменти за оценка на протеини (//services.mbi.ucla.edu/SAVES/) 26, 27 .

Използвайки този разработен протеинов модел, са внедрени виртуални скринингови процеси за изследване на големи бази данни от бази данни (напр. Specs, www.specs.net) в силико чрез молекулярни докинг проучвания (OpenEye, Fred 28, 29, 30). Молекулите бяха стандартизирани и тавтомерите и стереоизомерите бяха изчислени с помощта на Biovia Pipeline Pilot 20. Конформерите бяха генерирани с помощта на Omega 31, 32, 33 от Openeye, преди да се стикират, използвайки стандартни параметри с Fred 29 и да отбележат с функцията за оценяване chemgauss3. От горния списък са поръчани 11 съединения за експериментално валидиране.

Анализ на данни

Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). T-тестът на несдвоения студент е използван за определяне на значимостта между групите. Еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с post-hoc тест на Tukey е използван за определяне на значимостта между три или повече групи. Значимостта е посочена като p