Резюме

Нитрофураните са група от мощни широкоспектърни антибактериални лекарства, които също имат антипротозойна активност. Те все още се използват за лечение на много бактериални и протозойни инфекции при животни за производство на храни по целия свят, особено при свине и домашни птици, и са способни да предизвикат рак, както и други токсични странични ефекти в различни експериментални дизайни на модели. 1, 2, 3 Такива доказателства са приети като основа за забрана на употребата им в здравето на животните в много страни.

В края на 80-те години, базирайки се на идеята за предотвратяване на канцероген при човешките потребители чрез добавката Delaney, Американската администрация по храните и лекарствата забрани употребата на фуразолидон (FZD) и нитрофуразон (по-късно разширен до фуралтадон) за употреба в храната. лечение на заболявания на животни, отглеждащи храна. От гледна точка на САЩ, обаче, тази забрана може да бъде поставена под въпрос. Индукция на рак е установена при лабораторни животни, които са получавали директно големи количества от въпросния нитрофуран; 1, 2, 4, но хората не са изложени на риск да консумират нитрофуранов реагент от животински източници на храна, а по-скоро остатъци от основните метаболити: 2,3-дихидро-3-цианометил-2-хидрокси-5-нитро-1алфа, 2 -ди (2-оксо-оксазолидин-3-ил) иминометил-фуро-2,3-β-фуран, наричан още 3-амин-2-оксазолидон (AOZ), и второстепенен метаболит, N- (5-амино- 2) -фурфурилиден) -3-амино-2-оксазолидон (FOZ). Към днешна дата няма убедителни доказателства, че AOZ/FOZ може да причини генотоксични или канцерогенни промени.

Както при бозайниците, рибите метаболизират FZD до AOZ и FOZ чрез цитомома P-450; следователно те могат да се използват за изследване на канцерогенните ефекти, които FZD и неговите AOZ/FOZ метаболити могат да предизвикат. Известно е, че декоративните видове гиногенетични риби Poecilia formosa (моли), чиито родоначалници и потомци са генетично идентични, са податливи на туморно развитие, отчасти поради техния специален процес на размножаване. Този вид се счита за подходящ модел за тестване на канцерогенния потенциал на лекарствата, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и може да се използва за изследване на преките канцерогенни ефекти на FZD, както и косвените ефекти. AOZ. Сравнението на такива ефекти е извършено и при тилапия (Oreochromis niloticus).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Моли (Poecilia formosa)

Във всички случаи бяха използвани 1350 бенки, всяка с дължина 2 см и тегло приблизително 1,2 g. Рибите бяха разделени на 40 л стъклени водоеми с воден оборот 50% на седмица. Обем от 1 L въздух/мин се изпомпва (Wave Pumps, W Lim Corporation, El Monte, CA, USA) във всяка, за да се поддържа концентрация на кислород във вода от 5 ppm. Температурата на термостата беше 23 ° C. Променливите на водата (кислород, температура и рН) бяха измервани ежедневно (Pinpoint цифров оксиметър и термометър, American Marine Inc., Ridgefield, CT, Cherstertown, MA, USA). Амонякът, нитритът, твърдостта на водата и съдържанието на фосфати се измерват с помощта на автоматизирана система (Aqua LaMotte, Cherstertown, MA, USA).

В група Ам, три повторения от 100 мола се лекуват с 11 mg FZD/kg фураж/ден в продължение на 12 седмици. Всяка седмица седем мола репликация бяха демедуцирани и поддържани в 10% буфериран формалдехид. Пробите от риба се обработват за хистопатологичен анализ, като се използва стандартно включване във восък и оцветяване с хематоксилин-еозин. Включена е контролна група (Am control) от 100 необработени молари. В групата на Bm 300 жени, лекувани с FZD, са получили същата доза, както по-горе, и са разделени на три повторения и стимулирани да възпроизвеждат гупи (Poecilia reticulata) в края на 12-та седмица. Нетретирана контролна група от 100 мола също беше определена и индуцирана за репродукция, както е описано по-горе (Bm контрол). Потомците от Bm и контролните Bm групи се хранят със стандартна търговска диета, без FZD и след като достигнат размер от 1 cm, 20 риби за репликация се умъртвяват и обработват както по-горе за хистопатологичен анализ.

В групата на Cm, след 12 седмици прием на лекарства, са произведени 11 mg FZD/kg фураж, 350 малки, хранени с FZD фураж. След това това рибно брашно беше включено в търговската храна без време за центрофугиране при 500 g рибно брашно/kg търговски фураж. Общо 100 mollies (Cm1 група) са хранени с тази доза в продължение на 12 седмици. Изчислената доза AOZ е 1,25 μg/kg моли на биомаса, въз основа на консумацията на фураж 5% от теглото на биомаса. В края на този период рибите са обработени, както е описано по-горе, за търсене на тумори. Създадена е и нетретирана контролна група от 100 mollies (контролна Cm).

Тилапия (Oreochromis niloticus)

В тази фаза са използвани 325 младежки мъжки тилапии с дължина 2 см. Групата At включва 65 риби на реплика и три реплики плюс 65 допълнителни риби на необработена контролна група (At control). Животните са разпределени, както е описано по-горе. Рибата е получила търговска диета, допълнена с FZD в доза от 50 mg/kg фураж за 60 дни. В края на този период приблизително половината от тези риби бяха умъртвени и обработени за макроскопски и хистопатологичен анализ, както беше описано по-рано. Другата половина е направена от рибно брашно и е включена в търговска диета при 500 g/kg търговски фураж. Изчислената доза AOZ е 1,6 μg/kg биомаса от тилапия по отношение на консумацията на фураж от 5% от теглото на биомаса. Bt групата от 65 тилапии е хранена с този остатък от FZD, съдържащ диета в продължение на 12 седмици като форма на лекарство AOZ/FOZ. Контролните данни в нелекуваната група също се считат за контролна група за Bt групата.

Разпределението на групите в двата вида риби е обобщено в таблица 1.

Маса в пълен размер

Рибното брашно от къртици и тилапия е обработено за откриване на AOZ и FOZ, както е описано в Conneely et al 16 в три екземпляра, като се използва Inertsil ODS колона за разделяне (150 х 4,6 mm ID) и 5 ​​mM оксалова киселина-ацетонитрил (55: 45) като клетка. телефон. с UV-vis детекция при 265 nm (0,04 aufs).

Статистическият анализ на данните беше извършен с помощта на непараметричния точен вероятностен тест на Fisher.

РЕЗУЛТАТИТЕ

Оценените физикохимични променливи останаха постоянни във всички тестове и с двата вида, със следните средни стойности: температура 23,66 ± 1,2 ° C; рН 6,7 ± 0,6; амоний 0,730 ± 0,09 mg/l; фосфати 3,0 ± 0,5 mg/l; нитрати 0,41 ± 0,5 mg/l; кислород 5,6 ± 0,5 mg/l и твърдост на водата (измерена за съдържание на калций) 120 ± 6,5 mg/l.

HPLC анализът разкрива присъствието на AOZ в рибеното брашно, приготвено както с бенки, така и с тилапия в количества от 25 ± 8, 5 и 32 ± 4,8 μg/kg. В двете проби от рибно брашно са открити само количествено измерими следи от FOZ. Тези концентрации на AOZ позволяват дози на AOZ, съответстващи на 1,25 μg/kg молна биомаса и 1,6 μg/kg биомаса на тилапия.

Моли (Poecilia formosa)

Хистопатологичните изследвания на бенки показват ясна индикация за чернодробна стеатоза във всички проби от риби, третирани с FZD. Контролните животни не са показали такава лезия. От седмица 3 до края на проучването, третираните с FZD риби показват значително увеличение на меланохистоцитомите на черния дроб, панкреаса, бъбреците и половите жлези. Фигура 1а и б показват някои примери за тези констатации. Седмичната честота на бъбречно (а) и/или чернодробно (б) меланохистоцитомно туморно представяне е, както следва: няма през първите 2 седмици, след това 10, 24, 30, 36, 36, 44, 46, 48, 46 и 44, от 3 до 12 седмица. Точният тест за вероятност на Fisher показва, че в сравнение със седмици 1 и 2 и контролната група, групата, лекувана с FZD, е имала статистически значимо увеличение на туморите от седмици 3 до седмица 12 (P

неговите

Бъбречни (а) и чернодробни (б) меланохистоцитоми, индуцирани от мекотели, хранени с FZD (Poecilia formosa) при 0,011 g/kg храна/ден в продължение на 12 седмици.

Изображение в пълен размер

Тилапия (Oreochromis niloticus)

Не са наблюдавани тумори при нито една от третираните с FZD риби, нито при тилапия, хранена с тилапия. За разлика от това, чернодробна стеатоза е установена при всички тилапии, лекувани с FZD. Нелекуваните контролни риби не показват тази лезия.

ДИСКУСИЯ

Физико-химичните променливи, оценени във водата, не се променят значително в нито един набор от експерименти. Поради това беше направено заключението, че е много малко вероятно много малки наблюдавани колебания да повлияят на наблюдаваните резултати. Експерименталната канцерогенеза, използваща видове риби като алтернативни модели, е описана като динамична, привлекателна и ценна област на изследване. 11, 12 Poecilia formosa е женска линия от живи риби, които претърпяват чести мутации, имат клонално предаване и имат поне два наистина хипервариативни локуса, които показват, че мекотелите са податливи на мутационни промени както от физически, така и от химически стимули. 13, 14, 15 Всъщност този вид риба се счита за по-изгодна от използването на гризачи за тестване за потенциални канцерогени. Следователно, резултатите от този експеримент подкрепят използването на този вид риба за скрининг на потенциално канцерогенни вещества.

Основната цел на този експеримент беше да се сравнят/противопоставят ефектите от FZD или AOZ/FOZ хранене в два модела риби: единият склонен към образуване на тумор (Poecilia formosa) и другият (Oreochromis niloticus), който е неразличим. Също така в случай на моли, тествани са последователни поколения, за да се оцени възможното натрупване или геномния ефект върху зародишните клетки. Както се очаква, събраните по тази следа доказателства са в съгласие с установения факт, че FZD е канцероген. 1, 2, 4, 17, 18 В това конкретно проучване видът на FZD-индуциран рак се определя като меланохистиоцитом. Тези тумори стават по-ясни и по-тежки с времето на експозиция на FZD. За разлика от тях, нито един от тези тумори не е открит нито в бенки, нито в тилапия, хранени със замърсена с AOZ/FOZ моли или брашно от тилапия, или в потомство на бенки, оцелели през 12-седмичния период на лечение с FZD.

Предложеното предизвикателство, използвайки метаболити на FZD, свързани с протеини, беше извършено при концентрации на AOZ/FOZ в рибното брашно (от моли и от тилапии), които бяха значително по-високи от отчетените концентрации на AOZ в свинско месо при животни, третирани с FZD. процесът на дехидратация, необходим за приготвяне на рибното брашно. Тази методология се различава от простото добавяне на AOZ към фуража, тъй като се смята, че AOZ от животни, третирани с FZD, е ковалентно свързан с тъканни протеини, по-наподобяващ трофична верига.

Друга цел на този експеримент е да се оценят ефектите от натрупването на метаболити на FZD в хранителната верига в следващите поколения. При този тест не е открит забележим ефект. Всъщност липсата на способност на AOZ/FOZ да индуцира тумори, установена в тези проучвания, поне за бенки и тилапия, е по-подходяща за проучвания, показващи липса на свързана с тъканите мутагенност на AOZ със или без метаболитно активиране и използване на салмонела/. микрозомен анализ, 20 отколкото да се приеме, че AOZ/FOZ е потенциално потенциално токсичен за клетки като FZD. Klee et al. 21 не открива остра токсичност на AOZ или остатъци от храносмилането в чревните сегменти и Caco-2 клетки при концентрации, които са значително по-високи от максималните нива на остатъци, очаквани в храни от животински произход след прилагане на терапевтични дози. За да се определи обаче с по-голяма сигурност дали AOZ/FOZ е безвреден за потребителите, ще бъде полезно да се повтори този експеримент, като се използват по-големи количества пречистени и свързани с протеини AOZ и FOZ, както и да се удължи времето на експозиция. към тези реактиви.

Меланохистиоцитомите са доброкачествени тумори на меланомакрофагични центрове. Тези центрове са перфектно капсулирани от фиброзна съединителна тъкан, особено в черния дроб и различни органи като панкреаса и бъбреците. Известно е, че тези клетки имат висока скорост на клетъчно делене; следователно тяхната онкогенна отговорност става по-висока. Това изглежда е така за вида Poecilia formosa, който изисква само 3 седмици FZD излагане, за да развие такива тумори. Въпреки че комбинираните метаболити на AOZ/FOZ толерират само малки промени в химическата структура, те са достатъчни за драстично елиминиране на канцерогенната активност на FZD.

Стеаозата е често срещана находка при всички риби, лекувани с FZD, тилапия и моли, но тази находка не се наблюдава в контролните групи. Процентът на мазнините в диетата е бил достатъчен, т.е. 8% за молци и тилапия. Тъй като контролната риба не е показала стеатоза, е малко вероятно смилаемостта на източника на мазнини в търговски фураж да бъде отчасти отговорна за тази лезия. От друга страна, е доказано, че FZD може да предизвика такива промени. Въпреки това е много малко вероятно стеатозата да има някаква връзка с индуциращите тумора свойства на FZD или липсата на този ефект, наблюдавана за AOZ/FOZ.

При тилапия нито относително голяма доза FZD за 90 дни, нито тилапично хранене, замърсено с AOZ/FOZ, не предизвикват откриваеми тумори. Тези резултати също така предполагат, че FZD е едва канцерогенен за животни, произвеждащи храни, когато се използва в терапевтични дози и за разумно ограничен период от време. Всъщност задълбоченият преглед на литературата с помощта на автоматизирани банки с данни не разкри нито едно позоваване на директния тумор-индуциращ ефект на FZD при животински видове.

Рибите, дозирани с храна, допълнена с FZD и след това използвани за производство на рибно брашно за хранене на други риби, изглеждат достатъчна стъпка за освобождаване на FZD от нейните причиняващи рак свойства. Това мнение е в съответствие с последните доказателства, поставящи под въпрос опасностите, които FZD може да представлява за човешкото здраве, когато се използва като фуражна добавка във ветеринарната медицина. Тези резултати могат да бъдат взети предвид в страни, където нитрофураните все още се използват в здравето на животните и чиито правителства все още разследват тези вещества. Прилагането на тези резултати към оценките на риска за потребителите обаче не е било предмет на проучване и е отговорност на регулаторните агенции в съответните държави.