един

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Експресна формула километри един от друг по време на органогенезата на зебра
  • Дисрегулация разстояние един от друг нарушава развитието на космените клетки и ушните фоликули
  • Дисрегулация разстояния повлиява експресията на гени, свързани със слуха в ембрионите на данио
  • Оцеляването на космените клетки може да бъде свързано с функцията разстояния потискане zBax2 и подкрепа zMcl1b
  • дискусия
  • Материали и методи
  • Етично изявление
  • Поддържане и събиране на ембриони
  • Синтез на MO и иРНК с ограничена разстояние един от друг
  • микроинжекции
  • Наблюдение на ушните мехурчета
  • В тук ли си хибридизация на място
  • Оцветяване на космените клетки за преброяване и откриване на апоптоза/смърт
  • RT-PCR и qPCR
  • Статистически анализ
  • Терминологичен речник

елементи

  • апоптоза
  • Слухова система
  • Развитие на нервната система
  • генетика

абстрактно

Основното

Загубата на слух не само уврежда личното физическо и психическо здраве, но също така увеличава социалната и икономическа тежест. Увреждането на слуха може да бъде причинено от различни фактори, включително нарушения на космените клетки и структурите на вътрешното ухо, но дефектните молекулярни мишени остават неуловими. По този начин идентифицирането на нови молекулярни механизми, свързани с процесите на развитие на слуховите органи, като невромастична първична миграция, формиране на вътрешното ухо, диференциация и поддръжка на космените клетки, както и апоптоза на космените клетки, ще допринесе за по-доброто разбиране на загубата на слуха. патология. Това развитие на знанията ще улесни разработването на нови лекарства за профилактика на ототоксичността и защита на слуха.

В това проучване ние разгледахме функциите на мили мили от зебра при развитието и оцеляването на космените клетки и невромастовете и докладвахме първата връзка между активността на отдалечени мили и развитието на невромасти, космени клетки и ушни мехури, както и експресията на слухови гени и bcl-2 генното семейство. Заключваме, че Mil може да бъде важен регулатор на образуването и поддържането на слуховите органи в зебрите. Нашите открития ще допринесат за по-доброто разбиране на процесите на развитие на слуха и ще улеснят изследванията на отопротективните агенти.

резултатът

Експресионен модел на мили на разстояние по време на органогенезата на зебра

Хибридизацията на място през планината е използвана за откриване на модел на пространствено-времева експресия, отдалечен един от друг по време на ембрионалното развитие на зебрата. Експресията, отдалечена от километрите, се агрегира главно в енцефалната област, особено на границата на средния/задния мозък и вентралния заден мозък; и слабо изражение също се наблюдава при сомити, но не и при нотокорди при 24 hpf (Фигури 1а, a 'и a' '). Във фарингеалната фаза (48 hpf) транскрипцията се фокусира на мили от средния/задния мозък, средния мозък, вентралния заден мозък и дъските на пода на нервната тръба и кръвоносните съдове се появяват главно в правилни и дискретни модели в позиции. бъдещи невромасти по страничните линии (Фигури 1b, b 'и b' '). Въпреки това, по време на периода на излюпване (72 hpf), отдалечените мили на иРНК не бяха открити в страничните линии и в задната плоча на пода, но все още бяха силно изразени на границата среден/заден мозък, в мозъчния ствол и подовата плоча (Фигура 1в ). ). Тези резултати предполагат, че моделът на експресия на разстояние корелира с развитието на нервната система, включително мозъка, централната нервна тръба и нервната сензорна система при зебра.

Експресионен модел на мили на разстояние по време на органогенезата в зебра. In situ хибридизацията е извършена с антисенс РНК сонда на мили ( а ), ( б ) а ( ° С ); Сонда за чувствен смисъл, отдалечена от точката, беше използвана като сонда за отрицателен контрол ( д ). Вентралните секции бяха избрани от ембриони за първично изобразяване на глави и щамове. Цели тела бяха показани при 1 dpf ( а ), 2 dpf ( б ) и 3 dpf ( ° С ); съответните заглавия са показани в ( а ') а ( б ') и техните щамове са показани в ( а '') a ( б "). Черните стрелки показват планираните позиции на невромасти на постлатерални линии в ( б "). Черните половини скоби подписват средната/задната граница на границата в ( а ') а ( б '). На всички снимки главата е вляво, опашката вдясно; задната част нагоре на краката, долната част на плочата. Скалата е 310 μm в ( а ) а ( б ), 330 μm v ( ° С ), 380 μm v ( д ), 160 μm v ( а '), ( б '), 130 μm v ( а "), 180 μm v ( б '')

Изображение в пълен размер

Дисрегулирането на разстоянието един от друг нарушава развитието на космените клетки и ушните фоликули

Дефекти в развитието на отолитите и полукръговите канали, причинени от нарушена регулация на разстояние от километри. Ембрионите се инжектират с 40 μM MOmil или 40 ng/μl mil-mRNA на един до четири клетъчни етапа и се наблюдават при 2 dpf ( а ) и 3 dpf ( б ). В сравнение с WT ембрионите, необичайни форми на морски свинчета при 2 dpf се появяват при morphants, като увеличени и неовални уши (черни стрелки) и свиване на торбички (оранжеви стрелки) чрез инжектиране на MOmil (9/10). Въпреки че в контролната група misMO, отолитите имат форма (12/13), подобна на тази на WT (10/10). Ембрионите, третирани чрез инжектиране на иРНК на мили, показват деформирана, разделена или подобна на синцитий торбичка (червени стрелки) и по-малки утрикули (черна стрелка) чрез инжектиране на иРНК на мили (11/12). Хистограмата показва, че вариации в размерите на отолита, причинени от нокдаун на гена или свръхекспресия на гена, като се използват километри от площта на отолита, при които съотношението на сакулуса към площта на утрикула се използва като черта. Съставите и SD са получени от посочените ушни мехурчета. ** P-стойности

Генната експресия, свързана със слуха, е била намалена или увеличена надолу при ларвите на зебра. Транскрипцията на слухово свързани гени hmx2, fgf3, fgf8a, foxi1, otop1, pax2.1 и tmieb беше изследвана чрез RT-PCR в 48 hpf ембриони и беше установено, че зависи от концентрацията при морфанти (и ° С ) и се увеличи в милиметър-отдалечени ембриони, инжектирани с иРНК ( д а е ). Горните панели показват представителни резултати от RT-PCR електрофореза за MOmil ( а ) и иРНК, инжектирани с иРНК ( д ) и съответните хистограми от сканирането на плътността на трикратни RT-PCR резултати в ( ° С а е) ). Контролната група беше симулирана с инжектиран misMO и показана в ( б ) а ( д ). * P-стойности

Апоптозата на космените клетки се предизвиква чрез нокдаун. Ларвите на зебра при 6 dpf се оцветяват в смесен разтвор на трите багрила в продължение на 30 минути при 28 ° C, съгласно инструкциите на комплекта. а ) Изображения на ml1 невромаст в ларви, инжектирани с MOmil при 40 или 500 μM и misMO 40 или 500 μM отделно в сравнение с WT ml1 невромаст. б ), съответстваща хистограма за Фигура 5а. ( ° С ) Изображения на Neuromast O2, обработени по същия начин като neuromast ml1 MOmil и misMO, поотделно. д ), съответстваща хистограма за Фигура 5в. * P-стойности

Предишни изследвания показват, че Мил е отговорен за контролирането на миграцията и сливането на сърдечни клетки-предшественици в сърдечния регион и за последващото диференциране във функционален орган при сърдечно-съдово развитие. 5, 8, 24 В това проучване установихме, че функцията Mil може да бъде частично включена в миграцията и развитието на предшествениците на космените клетки и про-невромастичните праймоди при ALL и PLL (Фигура 3). Функционалното съответствие на Miles в различни органи предполага фундаментална обща роля на Mils за контролиране на миграцията на прекурсорни клетки и тяхното местоположение в органогенезата на зебра.

Това проучване първо предоставя доказателства, че функцията на гени, отдалечени на километри един от друг, участва в развитието на ушни везикули и странични клетъчни линии на косата и невромасти при зебра и че промяната в нивата на Mil може да регулира bcl-2 семейството zBax2 и Mcl1B експресията на гени.,

Материали и методи

Етично изявление

Това проучване беше проведено в строго съответствие с препоръките, посочени в Регламента за управление на лабораторните животни в Министерството на науката и технологиите на Китай. Протоколът е одобрен от Комитета по етика на експериментите с животни към Института по медицински биотехнологии към Китайската академия на медицинските науки (IMBF20060302).

Поддържане и събиране на ембриони

Щамът Zebrafish (Danio rerio) WT Tuebingen първоначално е получен от Университета по науки за живота, Университета в Пекин. Рибите са настанени при 28,5 ± 1 ° C в 14/10 часов цикъл светлина-тъмнина. 27 ембриони са получени чрез естествено чифтосване; Подходящи стадийни синхронни ембриони бяха събрани и записани с помощта на hpf и dpf 28. Ембрионите бяха фиксирани с 4% параформалдехид във фосфатно буфериран физиологичен разтвор за in situ хибридизация или потопени в реагент Trizol (Invitrogen) за изолиране на иРНК. Пигментацията в ембриони над 24 hpf е предотвратена чрез инкубация във фенилтиокарбамид (PTU) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) преди фиксиране.

Синтез на MO и иРНК с ограничено разстояние един от друг

Антисмислените морфолинови олигонуклеотиди MOmil и misMO са проектирани и закупени от Genetools (Philomath, OR, USA; //www.gene-tools.com). MOmil е използван за инхибиране на транслации на мили, като се свързва с места за започване на мили с последователност 5'-CCGCAAACAGACGGCAAGTAGTCAT-3 '. Контролът misMO 'е проектиран за отрицателен контрол на инжектирането, при който пет основи са загубени и подчертани в последователността 5'-CCCCAAACACACCGCAACTACTCAT-3'. И двата MO се разтварят повторно в 1.0 μmol/ml основен разтвор в ddH20.

Цялокилометровата CDNA последователност е клонирана от 24 hpf WT ембриони чрез верижна реакция с обратна транскриптаза полимераза (RT-PCR) и праймери, проектирани в съответствие с последователността на пробега на зебра, докладвана от GenBank (NM_001159970) и идентифицирана чрез секвениране (Sangon Biotech, Shanghai, Китай). Тази cDNA беше използвана като шаблон за синтез на иРНК със затворен цикъл, използвайки комплекта Ambion mMESSAGE mMACHINE T3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и продуктът беше тестван за качество и добив чрез електрофореза.

микроинжекции

За оцветяване на космените клетки, 1 nl от 20 μM MOmil или 20 ng/μl от mRNA със затворен цикъл в един до четири клетъчен стадий се инжектира отделно в WT ембриони; най-малко пет ларви при 6 dpf бяха използвани за преброяване на космените клетки на невромасти o1, 02, ml1, ml2 и io4 и за броене на невромасти на пост-латерални линии. За да се наблюдават живи ларви в ушите и да се броят космените клетки, на същия етап се инжектират ембриони с 1 nl 20 μM MOmil или 20 ng/μl mRNA с раздалечена капачка. За оцветяване на космените клетки чрез апоптоза, 1 nl MOmil при 40 μM и 500 μM и misMO при същите концентрации се инжектира в едноклетъчни до четириклетъчни ембриони; след това ларвите бяха събрани при 6 dpf. За RT-PCR анализ на гени, свързани със слуха, се инжектират 1 nl от 10, 20 или 40 μM MOmil и 10, 20 или 40 ng/μl запечатани mRNA от мили. същата ембрионална фаза. Ембрионите бяха инкубирани и събрани при 48 hpf. За qPCR анализ на zBax2 и zMcl1b, 1 nl от 40 μM MOmil и 50 ng/μl с капачка mRNA се инжектират отделно в същата ембрионална фаза. Ембрионите се инкубират при същите условия, както по-горе.

Наблюдение на ушните мехурчета

Морфологията и структурата на ушните везикули в ембрионите на Zebrafish, инжектирани с иРНК, инжектирана в WT, MOmil и Mil при 48 и 72 hpf, са наблюдавани под диференциален контрастен микроскоп IX71 (Olympus, Токио, Япония) и са записани с цифрова камера 500D ( Canon, Токио, Япония). Всяка група има повече от 10 ларви за преброяване на отолити и хистограма.

In situ хибридизация in situ

За in vitro синтез на РНК сонда, генна последователност, разделена на разстояние (километри), беше вмъкната в pBluescript KS (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ), която след това беше използвана като шаблон за синтез на сензорна и антисмислена РНК сонда, използвайки километра от комплекта за разделяне на DIG RNA (Roche Applied Sciences, Базел, Швейцария). За да се определят моделите на експресия на WT на разстояние една от друга, ембрионите бяха събрани при 24, 48 и 72 hpf. Ембриони, третирани с MOmil или mRNA инжекции, както и WT контроли, бяха събрани при 48 hpf. за потискане на пигментацията преди фиксиране в 4% параформалдехид за една нощ при 4 ° С. Ембрионите се третират с DNase преди хибридизация, за да се премахне псевдоположителната интерференция, причинена от геномна ДНК. Следващите стъпки от процедурата за хибридизация in-mount in situ следват стандартния протокол. 29

Оцветяване на космените клетки за преброяване и откриване на апоптоза/смърт

За преброяване на космените клетки ларвите на зебра при 6 dpf се анестезират в 0,016% трикаин (Sigma-Aldrich) и се инкубират във флуоресцентна боя YO-PRO-1 (Invitrogen) при крайна концентрация от 1 μmol/L за оцветяване на космените клетки. ядра 30 от петте невромасти, o1, ml1, ml2, o2 и io431, които бяха разположени на повърхността на ушната везикула наоколо. След това ларвите се визуализират с помощта на флуоресцентен микроскоп с обърната фаза IX51 (Olympus). Всяка група има пет ларви за оцветяване и преброяване на космените клетки. Снимките са направени с фотоапарат Canon 500D.

RT-PCR и qPCR

Маса в пълен размер

Статистически анализ

Статистически анализи на всички данни (средно ± SD) бяха извършени с помощта на еднопосочни ANOVA тестове и Р, 0,05 стойности бяха отбелязани като значими. Данните с ленти в хистограми представляват средни стойности и SD, които са получени от поне три изпълнения.