липса

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Мишките с дефицит на LMP7 са устойчиви на индуцирано от HFD затлъстяване
  • LMP7-дефицитните мишки са устойчиви на HFD-индуцирани метаболитни нарушения
  • Дефицитът на LMP7 няма ефект върху приема на храна, двигателната активност и разхода на енергия
  • Дефицитът на LMP7 намалява абсорбцията на липиди
  • LMP7 в клетките на костния мозък и не-костния мозък допринася за развитието на затлъстяване
  • Дефицитът на LMP7 облекчава възпалителните реакции в мастната тъкан
  • дискусия
  • методи
  • звяр
  • Микро-КТ анализ
  • Биохимичен тест
  • GTT и ITT
  • Хистология и имунохистохимия
  • RT-PCR анализ в реално време
  • BMT експерименти
  • Анализ на дихателните газове и опорно-двигателния апарат
  • Фекално събиране и екстракция на фекални липиди
  • Анализ на поточната цитометрия
  • Експерименти инвитро
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Ендокринна система и метаболитни заболявания
  • Метаболитен синдром
  • Затлъстяване

абстрактно

Затлъстяването е основен рисков фактор за инсулинова резистентност, хипергликемия, дислипидемия и хипертония, известно като метаболитен синдром и се е превърнало в глобален проблем на общественото здраве. Тези метаболитни нарушения увеличават риска от сърдечно-съдови заболявания и захарен диабет тип 2 и допринасят за повишена смъртност и заболеваемост. Въпреки че патогенезата на затлъстяването е сложна и включва различни фактори, скорошни проучвания разкриват, че възпалението в мастната тъкан е ключов патогенен играч 1, 2. В действителност, инфилтрация на макрофаги в мастната тъкан се наблюдава при животински модели на затлъстяване, както и при затлъстели хора с метаболитен синдром. Тези клетки са основен източник на възпалително производство на цитокини/хемокини, включително тумор некротизиращ фактор α (TNF-α), интерлевкин (IL) -1β и CC мотив хемокинов лиганд 2 (CCL2), известен също като моноцитен хемоаттрактант протеин-1 [ MCP-1].), Които от своя страна придобиват възпалителни клетки и допълнително насърчават възпалението на мастната тъкан. Все още обаче не е напълно ясно как възниква възпалението и кое се регулира в патофизиологията на затлъстяването.

резултатът

Мишките с дефицит на LMP7 са устойчиви на индуцирано от HFD затлъстяване

Първо изследвахме дали дефицитът на LMP7 може да повлияе на развитието на затлъстяване при мишки от див тип (WT) и мишки LMP7 -/-, хранени с нормална диета или HFD в продължение на 8 седмици. Въпреки че няма значителна разлика в увеличаването на телесното тегло между WT и LMP7 -/- мишките на нормална диета, LMP7 -/- мишките са натрупали значително по-малко телесно тегло от WT мишките при диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (Фиг. 1А Теглото на епидидимална и подкожна бяла мастна тъкан (WAT) е драстично намалено при LMP7 -/- мишки в сравнение с теглото при WT мишки (Фиг. 1В). Относителното тегло (тъканно тегло/телесно тегло) на всеки WAT при LMP7 -/- мишки е било по-ниско, отколкото при WT мишки (Фиг. 1C, черен дроб: намаление от 15,9%, епидидимно: 44,7%, мезентериално: 24,9%, периренално: 50,7 % и подкожно: 47,3%). Намалението се дължи хистологично на намаления размер на адипоцитите в WID на епидидима и подкожно (Фиг. 1D, E). Анализът с компютърна томография (CT) показва по-ниско тегло на висцералните и подкожните мазнини при LMP7 -/- мишки, отколкото при WT мишки (Фиг. 1F, G). Тези открития предполагат, че дефицитът на LMP7 е защитен срещу HFD-индуцирано затлъстяване.

( A - C ) Серумни TCHO, нива на TG ( A ), кръвна захар ( Б. ) и серумен инсулин ( ° С ) при WT и LMP7 -/- мишки на нормална диета и HFD (n = 8–12). ( D, E ) GTT резултати ( д ) и ITT ( Е. ) при WT и LMP7 -/- мишки на нормална диета и HFD (n = 8 за всяка). Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * p -/- или при нормална диета, или при HFD (Фиг. 3А), ние измерихме двигателната активност и енергийните разходи и в двата щама, за да оценим разликите в основния метаболизъм. Не са установени значителни разлики в двигателната активност, консумацията на кислород (VO 2), скоростта на дишане (RER), консумацията на въглехидрати (CH) и мазнините (FAT) между WT и LMP7 -/- мишки на нормална диета или диета с HFD . (Фиг. 3B, C). В подкрепа на този резултат, въпреки че експресията на Ucp1 (необвързващ протеин 1 или термогенин) беше увеличена в кафява мастна тъкан чрез HFD хранене, нямаше значителна разлика в експресията между WT и LMP7 -/- мишки (данните не са показани).

( A ) Прием на храна при WT и LMP7 -/- мишки на нормална диета (n = 7–8) и HFD (n = 13–14). ( Б. ) Локомоторна активност при WT и LMP7 -/- мишки на нормална диета и HFD (n = 8 за всяка). ° С. Данни за енергийните разходи. VO 2, RER, CH и FAT в WT и LMP7 -/- мишки на нормална диета и HFD (n = 8 за всяка). Данните са изразени като средна стойност ± SEM.

Изображение в пълен размер

Дефицитът на LMP7 намалява абсорбцията на липиди

За да изследваме противовъзпалителния ефект на дефицита на LMP7 в WAT, най-накрая оценихме дали адипонектин и лептин участват в този процес. Нивата на серумен адипонектин са значително по-високи при HMPD-хранени LMP7 -/- мишки в сравнение с HFD-хранени WT мишки (Фиг. 6G). Съответно, експресията на Adipoq, кодираща адипонектин, също се регулира в епидидималната WAT на LMP7 -/- мишки (Допълнителна фигура S3). Известно е, че транскрипционните фактори, кодирани от Pparg (активиран от пероксизома пролифератор рецептор γ), Cebpa (CCAAT/свързващ протеин енхансер [C/EBP] -α) и Cebpb (C/EBP-β), могат да бъдат индуцирани от експресията на Adipoq 12, 13. Експресията на всички тези транскрипционни фактори беше значително увеличена при LMP7 -/- мишки в сравнение с WT мишки (Допълнителна фигура S3). Нивата на серумен лептин бяха значително увеличени при WT мишки, хранени с HFD, и тези нива бяха значително намалени при LMP7 -/- мишки, хранени с HFD (Фиг. 6Н). Тези резултати предполагат, че адипонектинът и лептинът са замесени в подобряване на възпалението на мастната тъкан и метаболитните нарушения при LMP7 -/мишки. - .

дискусия

Основните открития на това проучване са както следва: (1) Дефицитът на LMP7 намалява натрупването на мазнини, предизвикано от HFD, и е защитен срещу затлъстяване; (2) Дефицитът на LMP7 подобрява непоносимостта към глюкоза и чувствителността към инсулин и подобрява метаболизма на липидите и глюкозата (3) няма разлика в приема на храна, двигателната активност и енергийните разходи между WT и LMP7 -/- мишки; (4) Дефицитът на LMP7 намалява абсорбцията на липиди; (5) Експериментите с BMT показаха, че LMP7 както в клетки, получени от костен мозък, така и в клетки, получени от костен мозък, допринася за развитието на HFD-индуцирано затлъстяване; (6) Дефицитът на LMP намалява възпалителните реакции като инфилтрация на макрофаги и експресия на хемокини, като същевременно увеличава производството на адипонекция. Резултатите от това проучване показват, че LMP7 допринася за възпалителни реакции в мастната тъкан върху макрофагите и за развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения. Доколкото ни е известно, това проучване предоставя първите доказателства, че LMP7 играе основна роля в развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения.

Има все повече доказателства, които предполагат, че възпалението играе важна роля за развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения. 12. Въпреки че има много доклади, описващи ролята на възпалението в техния процес, не е напълно ясно как възниква възпалението и как се регулира. Въпреки че е известно, че имунопротеазомата играе съществена роля в представянето на MHC антиген от клас I, последните изследвания показват, че LMP7 е необходим за производството на противовъзпалителни цитокини като TNF-α и IL-6 и за прогресирането на експерименталните артрит и колит 5, 6. В това проучване демонстрирахме, че дефицитът на LMP7 инхибира възпалението на мастната тъкан, затлъстяването и метаболитните нарушения: това предполага, че инхибирането на LMP7 има потенциала да предотврати и лекува затлъстяването и метаболитните нарушения. Всъщност няколко експериментални проучвания показват, че селективният LMP7 инхибитор ONX-0914 е високо ефективен при лечението на експериментален артрит и колит 5, 6. Следователно ефектът на този инхибитор на LMP7 върху затлъстяването и метаболитните нарушения трябва да бъде изследван в бъдещи проучвания.

Ние показахме, че дефицитът на LMP7 намалява експресията на панкреатичните липази, повишава съдържанието на липиди в изпражненията и инхибира повишаването на плазмените нива на TG след перорално приложение на масло или HFD. От друга страна, нивата на серумна глюкоза и инсулин в LMP7 -/- мишки не са били засегнати от нормална диета. LMP7 -/- мишки подобриха глюкозната непоносимост и инсулиновата чувствителност. По този начин LMP7 засяга външната и вътрешната секреторна функция на панкреаса и участва в храносмилането и хормоналната хомеостаза, което би било важно за метаболитното състояние на мишките.

В заключение ясно показахме, че дефицитът на LMP7 инхибира индуцираното от макрофагите възпаление в мастната тъкан и подобрява развитието на затлъстяване и метаболитни нарушения при мишки, хранени с HFD. Въз основа на нашите констатации, ние предполагаме, че дефицитът на LMP7 инхибира възпалението на мастната тъкан, като инхибира индулативната индукция на цитокини в макрофаги и адипонекулация, произведена от адипоцити. Освен това LMP7 засяга външната и вътрешната секреторна функция на панкреаса. Това проучване не само демонстрира, че LMP7 може да бъде потенциална терапевтична цел в превенцията и лечението на затлъстяване и метаболитни нарушения, но също така дава нови прозрения в механизма, лежащ в основата на патофизиологията на тези нарушения.

методи

Всички експерименти с животни са одобрени от Комитета за използване и грижи за опитни животни на Наръчника за лабораторни животни на Медицинския университет в Джичи и са извършени в съответствие с указанията на Медицинския университет в Джичи. Мишките C57BL/6J WT са закупени от Japan SLC, Inc. (Хамамацу, Япония). LMP7 -/- мишки са описани по-рано 4. Мъжки мишки (на възраст от 9 до 10 седмици) са били хранени или с 60 kcal% HFD (Research Diets: D12492, Japan LSG, Tokyo) или със стандартна чау (CE-2; CLEA Japan Inc., Osaka). Всяка мишка се претегля на всеки 2 седмици. В крайните точки мишките са гладували в продължение на 6 часа, претеглят се и кървят, за да получат серум. След перфузия тъканите бяха внимателно изрязани и претеглени.

Микро-КТ анализ

Микро-КТ анализът се извършва с помощта на LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Токио, Япония). Мускулната, висцералната и подкожната мастна маса бяха анализирани с помощта на софтуера LaTheta (Hitachi Aloka Medical).

Биохимичен тест

Кръв се събира от опашната вена на 6 часа гладни мишки. Нивата на кръвната глюкоза се измерват с помощта на глюкометър Terumo MEDISAFE® (Terumo Co., Токио, Япония). Нивата на TCHO и TG в серума или плазмата са измерени с помощта на системата FUJI DRI-CHEM (Fujifilm, Токио, Япония). Нивата на серумен инсулин, адипонектин и лептин бяха измерени с помощта на комплекти ELISA (Sibayagi, Gunma, Япония; R&D Systems Inc., Минеаполис, MN; и BioVendor R&D, Бърно, Чехия).

GTT и ITT

GTT се извършва на мишки на стандартна диета или HFD в продължение на 8 седмици. Мишките са гладували 6 часа предварително със свободен достъп до вода. След това се измерват нивата на кръвната захар непосредствено преди интраперитонеално инжектиране на глюкоза (1 g/kg телесно тегло във физиологичен разтвор) и впоследствие 15, 30, 60, 90 и 120 минути след приложението. ITT се извършва по подобен начин чрез инжектиране на инсулин (0,75 U/kg телесно тегло) вместо глюкоза.

Хистология и имунохистохимия

HE оцветяването и имунохистохимията за F4/80 и LMP7 бяха извършени, както е описано по-горе в 4, 23 .

RT-PCR анализ в реално време

Общата РНК се приготвя от бъбреците, използвайки ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Япония), съгласно инструкциите на производителя. RT-PCR анализът в реално време се извършва с помощта на система за откриване на термичен цикъл на куб Takara TP960 PCR (Takara Bio Inc, Shiga, Япония) за откриване на експресия на иРНК, както е описано по-рано 23. Експресията на гени се нормализира чрез експресия на Actb (β-актин), използвайки софтуера, предоставен със системата. Праймерите, използвани за RT-PCR анализ, са изброени в допълнителна таблица S1.

BMT експерименти

BMT мишки се генерират, както е описано по-рано 24. Използвахме мишки със зелен флуоресцентен протеин (GFP) като донори, за да проверим възстановяването на костния мозък след трансплантация с този протокол. Анализът на поточната цитометрия показва, че 8 седмици след BMT, периферните кръвни клетки се състоят от повече от 90% GFP-положителни клетки 24. Използвайки този протокол, генерирахме 3 вида BMT мишки: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- мишки).

Анализ на дихателните газове и опорно-двигателния апарат

Мишките бяха поставени индивидуално в метаболитна камера за 48 часа, за да им позволят да се адаптират към околната среда и да постигнат постоянна скорост на дихателен обмен (RER). Анализът на дихателните газове (O 2 и CO 2) беше извършен с помощта на система за анализ на метаболитни газове с отворен кръг, свързана директно към масспектрометър (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Япония). Консумацията на кислород (VO 2) и производството на въглероден диоксид (VCO 2) се измерват на всеки 5 минути за всяка клетка (една мишка). RER се изчислява като отношение VCO2/V02. Общата консумация на въглеводороди (CH) и мазнини (FAT) бяха изчислени, използвайки стехиометрични уравнения на Frayn, както следва: CH = 4,51 × VCO 2 - 3, 18 × V02 [mg/min] и FAT = 1,67 × (V02 - VCO) 2) [mg/min]. Локомоторната активност се определя на всеки 5 минути за всяка камера (една мишка) от броя на инфрачервените лъчи, прекъснати както в X, така и в Y посоките, използвайки система за мониторинг на активността (ACTIMO-100; Shinfactory, Fukuoka, Япония), комбинирана с отделни метаболитни камери.

Фекално събиране и екстракция на фекални липиди

Отделни изпражнения от HFD-хранени мишки се събират в продължение на 24 часа и се сушат чрез вакуумно центрофугиране. Изсушените фекалии се претеглят и смачкват в хаванче. Смлените изпражнения се прехвърлят в стъклена тръба и се претеглят отново. Липидите се екстрахират с хлороформ: метанол (2: 1) два пъти съгласно метод Folch 25 и се претеглят. Съдържанието на липиди се изчислява като% от теглото на смлени изпражнения.

Анализ на поточната цитометрия

Инфилтриращите левкоцити в епидидималната WAT се анализират чрез поточна цитометрия, както е описано по-горе 11. Данните за поточната цитометрия бяха получени с помощта на FACSVerse (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) и анализирани с помощта на софтуера FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA). Реагентите, използвани за анализ на поточната цитометрия, са изброени в допълнителна таблица S2.

Експерименти ин витро

Миши перитонеални макрофаги се култивират в RPMI1640 (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури), допълнени с 10% фетален говежди серум (FBS) и 1% антибиотик-антимикотик (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), като се използват плочи с 24 ямки. След 48 часа клетките се стимулират с 400 μM палмитат (10% BSA) 26 за 24 часа. Нивата на IL-1β, IL-6 и TNF-α в супернатантите бяха определени с помощта на ELISA комплекти (R&D Systems Inc.).

Статистически анализ

Резултатите с нормално разпределение бяха анализирани чрез параметричен несдвоен t-тест. Резултатите без нормално разпределение бяха анализирани чрез теста на Ман - Уитни, теста на Крускал - Уолис или надлъжния анализ. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуер Stata, издание 13 (Stata Corp., College Station, TX). P -значение на