насърчава

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Дефицитът на SRA увеличава регулирането на чернодробната експресия на ATGL
  • Нивата на ATGL и SRA индиректно се регулират в гладно състояние на мишките
  • SRA инхибира трансактивацията на ATGL промотор от Fox01
  • Инхибиторният ефект на SRA върху транскрипцията на ATGL е независим от инсулина
  • SRA инхибира трансактивацията на ATGL промотор чрез PPARy
  • дискусия
  • методи
  • Животни и диета
  • Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време
  • имуноблотинг
  • Клетъчна култура и лечение
  • Анализи на плазмиди, трансфекция, ретровирусна инфекция и репортерни гени
  • Генно заглушаване чрез къса финална РНК (shRNA)
  • ATGL медиирани анализи на FFA за β-окисление
  • Анализи на активността на ATGL
  • TAG анализ в хепатоцити
  • Статистически анализ
  • Препратки
  • Благодаря
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Инсулинова сигнализация
  • Механизми на заболяването
  • Транскрипционни регулаторни елементи

абстрактно

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD), най-честата форма на хронично чернодробно заболяване, се проявява чрез прекомерно натрупване на чернодробни мазнини. Наскоро показахме, че мишките с генетичен нокаут на дълго некодираща РНК (lncRNA) стероиден рецептор РНК активатор (SRA) (SRAKO) са устойчиви на затлъстяване, предизвикано от затлъстяване с висок мазнини, с фенотип, който включва подобрен глюкозен толеранс и нарушена чернодробна стеатоза механизмът е изследван в това проучване. Установихме, че чернодробните нива на SRA и мастната триглицеридна липаза (ATGL), основната чернодробна триацилглицеролова (TAG) хидролаза, са обратно регулирани чрез гладуване при мишки и експресията на ATGL в черния дроб се индуцира от SRAKO при нормална и високомаслена диета (HFD) . ) хранене. Загубата на SRA в първични хепатоцити или хепатоцитна клетъчна линия повишава регулирането, но принудителната експресия на SRA инхибира експресията на ATGL и β-окисляването на свободната мастна киселина (FFA). SRA инхибира активността на ATGL промотора, по-специално чрез инхибиране на иначе индуциращите ефекти на транскрипционния фактор, виличен протеин O1 (FoxO1). Нашите данни разкриват нова функция на SRA за насърчаване на чернодробната стеатоза чрез потискане на експресията на ATGL.

Напоследък се появиха дълги некодиращи РНК (lncRNAs) като важни регулатори на различни биологични процеси, включително плурипотентност на стволови клетки, ембриогенеза, клетъчна диференциация 12, 13 и чернодробен липиден метаболизъм 14. Активаторът на РНК стероидни рецептори (SRA) първоначално се характеризира като lncRNA, която действа като РНК коактиватор за увеличаване на експресията на зависимия от стероидния ядрен рецептор 15. Впоследствие е доказано, че SRA функционира като РНК коактиватор за нестероидни ядрени рецептори 16, 17 и играе важна роля в миогенезата 18, 19, стероидогенезата 20, туморогенезата на гърдите 21, 22, 23 и кардиомиопатията 24. Генът Sra1 също произвежда алтернативен транскрипт, който кодира протеин, обозначен като SRAP 25, 26, въпреки че функцията на SRAP е до голяма степен неизвестна.

Наскоро показахме, че SRA насърчава диференциацията на адипоцитите и стимулираното от инсулина усвояване на глюкоза в адипоцитите in vitro чрез много механизми, като коактивация на транскрипционна активност на активирания от пероксизома пролифератор γ (PPARγ), инхибиране на възпалителната генна експресия, свързана с рецептора на адипоцит 27, или насърчаване на експресията на адипоцитни рецептори., 28. За да оценим функцията на SRA in vivo, генерирахме глобални мишки с нокаутиращи Sra1 гени (SRAKO) 29. В допълнение към намаленото тегло на мазнините, мишките SRAKO намаляват нивата на TAG в черния дроб и устойчивостта на индуцирано от диетата затлъстяване. За първи път тези данни предполагат роля на SRA в метаболизма на черния дроб в липидите 29. Тук изясняваме механизма, като показваме, че SRA инхибира транскрипционната активност на O1 протеина на вилицата (FoxO1) чрез независим от инсулина път в хепатоцитите, като по този начин намалява експресията на неговия низходящ ген ATGL, ключов липолитичен ензим, и впоследствие намалява β -окисляване.хепатоцити FFA.

резултатът

Дефицитът на SRA увеличава регулирането на чернодробната експресия на ATGL

4-кратно при WT-HFD мишки a

2 пъти при мишки с дефицит на лептин (ob/ob) в сравнение с мишки WT-Chow (фиг. 3а, ляв панел)). За разлика от това, при състоянието на насищане нивата на SRA бяха относително по-високи и непроменени при дефицит на HFD или лептин.

( а ) Нивата на SRA и ATGL mRNA в черния дроб на WT-chow (n = 5) или WT-HFD (n = 6) и ob/ob (n = 8) мишки (на възраст 20 седмици), определени на гладно или хранене, бяха определени с RT-qPCR. MRNA нивата се нормализират до експресия на 36В4. Данните са представени като средно ± SE и са изразени като кратна промяна спрямо WT-chow мишки. ( b, c ) Чернодробни или чернодробни екстракти от WT-chow, WT-HFD и ob/ob мишки бяха имуноблотирани с anti-Fox01, anti-ATGL, anti-laminB1 и анти-β-актин антитела. б ) Мишки на гладно. ° С ) мишки в храната. ( д ) Чернодробни ядрени екстракти от WT или SRAKO (KO) мишки, хранени с чау или HFD, бяха имуноблотирани с антитела срещу Fox01 и anti-laminB1. ( б - г ) Показани са десните панели, количествено определяне на лентите в имуноблоти. * стр. 33. Освен това липсата на SRA не повлиява съдържанието на ядрен протеин FoxO1 в черния дроб (фиг. 3d). Тези резултати предполагат, че SRA регулира експресията на ATGL чрез механизъм, който не включва промяна в нивата на ядрен FoxO1.

SRA инхибира трансактивацията на ATGL промотор от Fox01

Добре известно е, че Fox01 има места за свързване в промоторната област -3 kb на гена ATGL и засилва регулацията на транскрипцията на ATGL в адипоцити 33. Fox01 регулира както производството на чернодробна глюкоза, така и метаболизма на липидите 34, 35. Свръхекспресията на Fox01 повишава нивата на тРНК и ATGL протеин в хепа1-6 клетки (фиг. 4а), което предполага, че транскрипцията на ATGL се регулира директно от FoxO1 в хепатоцитите. За по-нататъшна оценка използвахме ATGL репортерния луциферазен промотор с 3 kb промотор и установихме, че този вектор показва 75 пъти по-висока луциферазна активност от pGL3-базовата контрола (Фигура 4b). Котрансфекция на плазмид, кодиращ SRA РНК, но не и SRAP протеин инхибиран луцифераза, задвижван от ATGL промотора

25% (фиг. 4в). За да се потвърди дали SRA проявява своя инхибиторен ефект чрез Fox01, Fox01 и SRA са били котрансфектирани с луциферазната система (Фиг. 4г). Както се очакваше, само Fox01 увеличи луциферазата, задвижвана от промотора на ATGL, до 5 пъти, но котрансфекцията на SRA потиска този медииран от Fox01 ефект (Фигура 4г). Способността на SRA да инхибира Fox01-медиираната луциферазна активност е зависима от дозата (Фиг. 4д). Освен това, инхибиторът на Fox01 AS1842856 (1 μM) индуцира непрекъснато потискане на активността на Fox01 (Допълнителна фигура S4a) и намалява инхибиторния ефект на SRA върху активността на ATGL промотора (Фигура 4f). За разлика от свръхекспресията на SRA, нокдаунът на SRA повишава активността на ATGL промотора (фиг. 4g, h), което е предотвратено от AS1842856 (фиг. 4h). Като цяло тези данни предполагат, че SRA регулира експресията на ATGL, като инхибира способността на Fox01 да насърчава транскрипцията на ATGL.

ATGL е основната чернодробна TAG хидролаза, която контролира чернодробното FFA окисление 8, 9. Той има по-висока субстратна специфичност за TAG, отколкото за хормоночувствителната липаза (HSL), която преди се считаше за доминиращата TAG хидролаза 46. В това проучване открихме, че SRAKO регулира нивата на mRNA и протеини в чернодробния ATGL както при HFD, така и при нормално хранене с фураж (Фиг. 1). В допълнение, експресията на ATGL се индуцира в SRAKO хепатоцити (фиг. 2а), което води до повишена активност на ензимите ATGL в черния дроб (допълнителна фигура S2) и активиране на телесното производство на хепатоцитни кетони (фиг. 2б), продукт и индикатор за FFA β-окисление. Подобни резултати бяха открити и в хепато-6 хепатоцитната клетъчна линия с нокдаун на ендогенен SRA (фиг. 2в, г). За разлика от това, принудителната експресия на SRA инхибира експресията на ATGL и намалява β-окислението на FFA (фиг. 2д, f). Важно е, че ние демонстрираме, че SRA се индуцира при затлъстяване на черния дроб след гладуване (фиг. 3а) и че чернодробните нива на SRA и ATGL са косвено корелирани при мишките WT-Chow, WT-HFD и ob/ob (фиг. 3а). B) . По този начин, нивата на SRA варират в зависимост от енергийните нива и метаболитните условия, които водят до обратна експресия на ATGL в черния дроб.

Транскрипционният фактор Fox01 индуцира експресия на ATGL в адипоцити 33 и хепатоцити (Фигура 4а). Комбинацията от подходи, включително in vivo генетичен нокаут и свръхекспресия, нокдаун и проучвания на инхибитори в култивирани клетки, предполага, че SRA инхибира транскрипцията на ATGL чрез намеса в транскрипционната активност на Fox01 (Фигури 1, 3 и 4).

В адипоцитите инсулинът индуцира освобождаването на Fox01 от ядрото в цитоплазмата, като по този начин инхибира транскрипцията на ATGL33. Предишни проучвания с адипоцити 27, 28 и настоящото проучване с хепатоцити (фиг. 5а) показват, че SRA стимулира индуцираното от инсулин фосфорилиране на Akt, Erk1/2 и целевата им цел FoxO1, което изглежда противоречи на предишните ни данни, че SRAKO атенюира инсулина. HFD-индуцирано съпротивление 29. Въпреки това, подобрената чувствителност към инсулин при SRAKO мишки вероятно е вторична за отслабването на чернодробната стеатоза и затлъстяването. Инсулинът и SRA инхибират медиираната от Fox01 транскрипция на ATGL, но механизмите се различават, тъй като само инсулинът предизвиква ядрен износ на Fox01 (Фигура 5b) и репресивният ефект на SRA не зависи от инсулина. Възможно е ефектът на SRA върху насърчаването на инсулиновата сигнализация да е твърде малък, за да модулира ядрената локализация на Fox01, поне при условията на това проучване.

PPARy, друг транскрипционен фактор, регулиращ транскрипцията на ATGL в адипоцити 39, 47, беше потвърдено, че има подобен ефект в хепатоцитите, когато се активира от PPARy лиганд (Фиг. 6а). Въпреки това, повишената транскрипция на PPGy-активиран ATGL от лиганд беше намалена до базални нива от SRA (фиг. 6b), ефект, независим от Fox01 (фиг. 6в). Въпреки потенциалната важност на пътя на SRA-PPARy-ATGL, проучвания, използващи Fox01 и PPARγ инхибитори, показват, че при липса на PPARγ лиганд, SRA медиира своите репресивни ефекти върху транскрипцията на ATGL от Fox01, а не PPARγ (Фигури 4 и 6).

Молекулярният механизъм, лежащ в основата на SRA, действащ като репресор в Fox01 и PPARγ-медиирана ATGL транскрипция, остава да бъде напълно изяснен. Предишни проучвания предполагат, че SRA може да функционира като РНК коактиватор чрез комплексиране с протеинови коактиватори като SRC-1 15 и че може да функционира като скелетна молекула 19, 20, 48 в тези комплекси. Въпреки това, SRA има и репресивна функция и взаимодейства с NR корепресорите SHARP 49 и SLIRP 50 и действа като скеле от репресивни комплекси, съдържащи HP1, LSD1, HDAC1/2 и CoREST, за да заглуши гените, регулирани от прогестероновите рецептори, в отсъствието на хормони 51. В допълнение, SRA може да образува комплекси с тритораксови групи и комплекси от поликомбен репресор 2, за да достави активиращи или репресивни модификации на хистон 52. Следователно SRA може да изпълнява както коактивационни, така и репресивни функции в зависимост от контекста си. Предполагаме, че в черния дроб SRA действа като скеле за набиране на репресивен комплекс за потискане на транскрипцията на AT01, медиирана от Fox01 и PPARγ.

В обобщение, настоящото проучване показва, че чернодробната експресия на SRA и ATGL е обратно свързана и загубата на SRA в миши черен дроб или хепатоцити повишава експресията на ATGL предимно чрез насърчаване на индуктивния ефект на FoxO1, което може да доведе до повишена FFA β-окисление и осигуряват защита срещу чернодробна стеатоза при диета, индуцирано затлъстяване.

методи

Животни и диета

SRAKO мишки се генерират, както е описано по-горе 29. Мишки с дефицит на лептин (ob/ob) са закупени от Моделния център за изследване на животни на Университета в Нанкин, Китай. Мишките бяха настанени в бариерно съоръжение без патогени с 12-часов цикъл светлина/тъмнина и им беше предоставен свободен достъп до храна и вода. На възраст от 8 седмици, мишките SRAKO (KO) и дивите отпадъци (WT) са били хранени или със стандартна лабораторна диета с гризачи (Chow) (Xietong Organism, Нанкин, Китай) или с високо съдържание на мазнини (HFD, 60% мазнини, 20% въглехидрати, 20% протеини; Research Diets, New Brunswick, USA) за 12 седмици. ob/ob мишките са хранени с чау диета до 20-седмична възраст. Мишките се умъртвяват по време на леката фаза след лишаване от храна в продължение на 16 часа или без гладуване. Тъканите се изолират незабавно, претеглят се и се съхраняват в течен азот. Всички животновъдни и експерименти с животни отговаряха на указанията на Наредбите на медицинския университет в Нанкин за експерименти с животни и бяха одобрени от Комитета за експерименти с животни към Медицинския университет в Нанкин.

Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време

Общата РНК беше извлечена от черен дроб или клетки с помощта на RNAiso Plus (Takara Bio Inc., Далиан, Китай) и беше обратно транскрибирана с помощта на M-MMLV обратна транскриптаза с инхибитори на RNasin рибонуклеаза (Promega Biotech Co., Ltd, Пекин, Китай) според протоколите на производителя. qPCR беше извършен с помощта на SYBR Premix Master Mix (Thermo Scientific Inc., Шанхай, Китай). Последователности на праймера за Pparα, Mcad, Lcad, Cpt1α, Cpt2, Cd36, Fatp1, L-fabp, Acsl1, Acox1, Acaa1b, Acaa2, Atgl, Hsl, Acly, Fasn, Acc1, Acc2, Scd1, Mtgpat1, Dgat1, Dgat1, Mttp, Apoc2, Apoc3, Vldlr и Sra са обобщени в допълнителна таблица S1. Експресионните нива на mRNA са нормализирани до тези на рибозомния протеин, големи, P0 (36B4) mRNA.

имуноблотинг

Протеини от чернодробни лизати, клетъчни лизати, клетъчно ядро ​​и клетъчна цитоплазма бяха извлечени чрез предишни методи 53 или комплекти (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Първичните антитела се използват при разреждане 1: 1000. Антифосфо-FoxO1 (# 9461), FoxO1 (# 2880), фосфо-ERK1/2 (# 4370), ERK1/2 (# 4695), фосфо-Акт (Thr308) (# 9275), фосфо-Акт (Ser473 ) (# 9271), Akt (# 4685), ATGL (# 2439), PPARγ (# 2435), ламин В1 (# 13435), β-актин (# 3700) и конюгирани анти-миши или заешки IgG, конюгирани с пероксидаза от хрян закупен от технологията за клетъчна сигнализация. Anti-SRAP антитяло (# A300-743A) е закупено от Bethyl Laboratory, Inc.

Клетъчна култура и лечение

HepG2 човешки хепатокарциномни клетки и Hepa1-6 миши хепатокарциномни клетки се култивират в модифицирана среда на Dulbecco Eagle (DMEM; Invitrogen), допълнена със 100 mg/ml стрептомицин сулфат (Sigma - Aldrich), 100 U/ml пеницилин G (Sigma - Aldrich) и 10% (v/v) фетален говежди серум (FBS; Invitrogen) и се поддържа при 37 ° C в атмосфера от 5% CO 2 и 95% въздух. Първичните хепатоцити са изолирани от мишки от див тип или SRAKO и са отгледани в среда E на Уилям (Sigma - Aldrich) с FBS и антибиотици, както е описано по-рано 54. Клетките се гладуват в серум в продължение на 5 часа, последвано от лечение със или без инсулин (10 пМ) в продължение на 5 минути. Преди лечение с инсулин, клетките бяха предварително обработени с MG132 (Sigma - Aldrich, 50 μM), вортманин (Sigma - Aldrich, 1 μM) или траметиниб (MedChem Express, 1 μM) за 30 минути.

Анализи на плазмиди, трансфекция, ретровирусна инфекция и репортерни гени

Генно заглушаване чрез къса финална РНК (shRNA)

Съгласно предишни методи 27, ендогенната SRA на мишка в клетки Hepa1-6 беше унищожена от инфекция с лентивирус, експресиращ shRNA, насочен срещу SRA, генериран в 293T клетки, допълнен с 8 mg/ml Polybrene (Sigma) след свързване през нощта. Инфекцията се повтаря на интервали от 8 до 12 часа. Клетките бяха подложени на експерименти 72 часа след втората инфекция.

ATGL медиирани анализи на FFA за β-окисление

Хепатоцитите или Hepa1-6 клетките се култивират в пълна среда с олеинова киселина (100 цМ) в продължение на 16 часа. След това клетките се инкубират в безсерумен, без фенол червен и без глюкоза DMEM (Sigma) в продължение на 4 часа с или без (R) -бромоенол лактон (25 μM, Cayman Chemical company, Ann Arbor, USA). Кетонните тела, продуктите на FFA β-окисление, освободени в средата, бяха анализирани с D-3-хидроксибутиратен набор за анализ (Megazyme Internatioanl Ireland, Bray, Ireland). ATGL-медиираното FFA β-окисление се изчислява като разлика в производството на D-3-хидроксибутират между клетки, третирани със или без специфичния за ATGL инхибитор, (R) -бромоенол лактон, нормализиран до нивото на клетъчния протеин, т.е. частта от D-3 -производството на хидроксибутират се потиска с (R) -бромоенол лактон.

Анализи на активността на ATGL

TAG хидролазната активност в чернодробните лизати се анализира с комплект за анализ на TAG хидролаза (Jiancheng Bioingineering Institute, Nanjing, Китай) и се нормализира до нивата на чернодробния лизатен протеин. Активността на ATGL се изчислява като разликата в активността на TAG хидролаза в присъствието и отсъствието на (R) -броменол лактон (25 μM), т.е. частта от активността на TAG хидролаза, потискаща се с (R) -бромоенол лактон.

TAG анализ в хепатоцити

Хепатоцитите се хомогенизират в 0.1 М НС1 и се екстрахират с хлороформ-метанол (2: 1). Органичната фаза се изпарява, за да изсъхне. Липидните остатъци се разтварят в изопропанол и се измерват с помощта на комплекта за анализ на TAG (GPO-PAP; Dongou Bioengineering Co. Ltd, Wenzhou, Китай). Нивата на TAG се нормализират до нивата на протеин в хепатоцитите.

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средна стойност ± SE. Данните между групите бяха анализирани чрез t-тест на Student или еднопосочен ANOVA, последван от множествено сравнение на Bonferroni - Dunn. Разликите се считат за значими за P