- елементи
- абстрактно
- Въведение
- резултатът
- Асоциация на нивата на серумен HDL холестерол и адипокин при лица с коремно затлъстяване
- HDL отслабва индуцираната от вол-LDL секреция на висфатин и резистин в 3T3-L1 диференцирани адипоцити
- HDL инхибира индуцираното от вол-LDL натрупване на свободен холестерол в цели адипоцити и в обогатени с ER мембрани
- HDL потиска секрецията на висфатин и индуциран от ox-LDL или TM резистин в 3T3-L1 адипоцити
- HDL облекчава ER реакцията на стрес в 3T3-L1 адипоцитите, индуцирани от вол-LDL или TM
- HDL увеличава експресията на рецептор тип I (SR-BI) за поглъщане и инхибира индуцираното от вол-LDL натрупване на FC чрез SR-BI рецептора в 3T3-L1 адипоцити
- дискусия
- методи
- елементи
- Анализ на серума
- Клетъчна култура
- Изолиране и окисляване на LDL
- Измерване на нивата на адипокин в средата
- ER мембранно фракциониране и определяне на свободния холестерол (FC)
- Western Blots
- Количествена PCR в реално време
- Проточна цитометрия
- Малка трансфекция на интерферираща РНК (siRNA)
- Измерване на ендотоксини
- Статистически анализ
- Повече информация
- Допълнителна информация
- Word документи
- Допълнителна информация
- Коментари
елементи
абстрактно
От появата на адипоцита като „метаболитно активен орган“, който отделя хормони, цитокини и хемокини, нараства интересът към разбирането на неговите функции при затлъстяването и отслабването 1. Мастната тъкан секретира няколко биоактивни молекули, наречени адипокини, като α-TNF (α) TNF-α, интерлевкин-6 (IL-6) и моноцитен хемоаттрактант протеин (MCP-1) 2. Висфатин и резистин са нови адипокини на висцералната мастна тъкан 3, 4. Нискостепенното хронично възпаление се определя като отличителен белег на затлъстяването при дисрегулация на производството на адипокин, получено от адипокин. Те се откриват както в серума, така и в мастната тъкан и са активни фактори, които модулират ефектите от затлъстяването и свързаните с това съпътстващи заболявания 5, 6 .
Новосинтезирани, свързани с мембраната секретирани протеини, са правилно сглобени и сглобени от шаперони в ендоплазмения ретикулум (ER) 7. Неизправността на адаптивния капацитет на ER води до активиране на ER стрес, известен също като усъвършенстван протеинов отговор (UPR). Известно е, че ER стресът се увеличава в черния дроб и мастната тъкан на затлъстели мишки 8, 9 и затлъстели хора 10. Индукцията на ER стрес в мастната тъкан модифицира секрецията на адипокин и предизвиква възпаление 11. Неотдавнашни проучвания показват, че окисленият липопротеин с ниска плътност (ox-LDL) може да стимулира експресията и секрецията на висфатин и да устои чрез активиране на хомоложния ER стрес-C/EBP (CHOP) протеинов път, който може да бъде свързан с повишаване на холестерола. натоварване на адипоцити, докато тауроурсодезоксихолевата киселина (TUDCA) предпазва адипоцитите от индуцирана от вол-LDL секреция на адипокин чрез инхибиране на активирането на ERS 12. По този начин може да се предположи, че инхибирането на ER стреса може да бъде ефективен подход за модулиране на секрецията на адипокин, потискане на възпалението и намаляване на риска от затлъстяване и неговите усложнения.
Добре известно е, че липопротеинът с висока плътност (HDL) има значителни противовъзпалителни и антиатерогенни свойства. Въпреки това, механизмът, чрез който HDL предотвратява атерогенезата, не е напълно изяснен. Последните проучвания предполагат силна връзка между циркулиращия плазмен резистин и атеросклерозата 13. HDL може допълнително да намали натрупването на липиди в адипоцитите 14, което вероятно може да е отговорно за благоприятните ефекти на HDL върху секрецията на адипокин. Следователно, ние предположихме, че регулирането на секрецията на адипокин и натрупването на липиди в адипоцитите от HDL може да допринесе за неговите антиатерогенни свойства. В това проучване ние изследвахме ефекта на HDL върху секрецията на адипокин и натрупването на липиди с акцент върху неговата роля за намаляване на регулацията на ER-медиираното възпаление-CHOP in vitro и in vivo. .
резултатът
Асоциация на нивата на серумен HDL холестерол и адипокин при лица с коремно затлъстяване
Изходните демографски данни за субектите са показани в Допълнителна таблица 1. В проучването са включени тридесет и четири пациенти с коремно затлъстяване и не са включени пушачи или пиячи. Както е показано на Фигура 1А, се забелязва отрицателна корелация между серумните нива на висфатин и серумните нива на HDL-C. Установена е същата корелация между HDL-C с резистин и TNF-α (фиг. 1В, С).
Проучването включва 34 субекта с коремно затлъстяване. ( A ) Разпръснат график на HDL-C (mmol/L) и висфатин (ng/ml) с линеен регресионен анализ. ( Б. ) Разсеян график на HDL-C (mmol/L) и резистин (ng/ml) с линеен регресионен анализ. ( ° С ) Разпръснат график на HDL-C (mmol/L) и TNF-α (ng/ml) с линеен регресионен анализ.
Изображение в пълен размер
HDL отслабва индуцираната от вол-LDL секреция на висфатин и резистин в 3T3-L1 диференцирани адипоцити
Въз основа на отрицателната корелация на HDL-C и провъзпалителни адипокини при пациенти със затлъстяване, е установен in vitro модел на възпалителен адипоцит, индуциран от вол-LDL, за изследване на защитната функция на HDL. Както е показано на ФИГ. 2, инкубацията на адипоцити с вол-LDL води до значително увеличаване на регулирането на освобождаването на висфатин и резистин, докато повишената регулация е значително намалена от дозозависима предварителна обработка на HDL (фиг. 2А, В) и зависима от времето (фиг. 2С, Д).
( A, Б. ) Адипоцитите бяха предварително обработени с различни концентрации на HDL в DMEM с 1% FBS в продължение на 2 часа, последвано от инкубация с вол-LDL и 10 μg/ml Sandoz 58035 в продължение на 48 часа и след това нивата на висфатин и резистин в клетъчната среда бяха определени от ИФА. ( ° С, д ) Адипоцитите бяха инкубирани с ox-LDL и sandoz58035 (10 μg/ml) в продължение на 48 часа в комбинация с HDL (100 μg/ml) за различно време и след това количествата висфатин и резистин, освободени в клетъчната среда, бяха определени от ELISA анализ. Данните са представени като средна стойност ± SEM от поне шест независими експеримента. * P # P ## P
Адипоцитите бяха предварително обработени с HDL в DMEM с 1% FBS в продължение на 2 часа, последвано от инкубация с вол-LDL и 10 μg/ml Sandoz 58035 в продължение на 48 часа и след това ( A ) Съдържанието на FC в цели клетки се анализира с наличен в търговската мрежа комплект. ( Б. ) Обогатените с ER мембрани от адипоцити се фракционират чрез центрофугиране с градиент на захароза, както е описано в раздела "Методи", и пелетната фракция се тества за съдържание на FC. Данните са представени като средна стойност ± SEM от поне четири независими експеримента. * P # P
( A, Б. Адипоцитите бяха предварително обработени с HDL или PBA в DMEM с 1% FBS за 2 часа, последвано от инкубация с ox-LDL и sandoz58035 (10 μg/ml) в продължение на 48 часа. ( ° С, д ) Адипоцитите бяха предварително обработени с HDL или PBA в DMEM с 1% FBS в продължение на 2 часа, последвано от инкубация с TM и sandoz58035 (10 μg/ml) за 24 часа. Нивата на висфатин и резистин в клетъчната среда се определят чрез ELISA анализ. Данните са изразени като средна стойност ± SEM от поне 5 независими експеримента. ** P # P
( A, Б. ) Адипоцитите бяха предварително обработени с HDL в DMEM с 1% FBS за 2 часа, последвано от инкубация с ox-LDL и sandoz58035 (10 μg/ml) в продължение на 48 часа и след това ( A ) SR-BI и PDZK1 нивата на иРНК и протеини бяха оценени чрез PCR в реално време и Western blotting и Б. ) мембранната експресия на SR-BI беше измерена чрез поточна цитометрия. ( ° С - F ) Адипоцитите бяха трансфектирани с siRNA срещу SR-BI или siRNA с отрицателен контрол в продължение на 48 часа и след това клетките бяха предварително обработени с HDL (100 μg/ml) в продължение на 2 часа, последвано от инкубация с оксо-LDL (100 μg/ml) и sandoz58035 (10 μg/ml) за 48 часа. След това заглушаването на SR-BI беше потвърдено от Western blot ( ° С ). Нива на FC в адипоцитите ( д ) и богати на ER фракции ( Е. ) бяха анализирани с помощта на наличен в търговската мрежа комплект. Допълнително бяха оценени нивата на CHOP протеин ( F ), ER стресов маркер, от Western blot. Данните се изразяват като средна стойност ± SEM от поне четири независими експеримента. * P # P ## P & P
HDL може да потисне индуцираното от вол-LDL натрупване на FC в адипоцитите чрез регулиране на SR-BI и впоследствие да предотврати възпаление на адипоцитите, медиирано от ER стрес-CHOP, индуцирано от вол-LDL.
Изображение в пълен размер
дискусия
Нарушаването на хомеостазата на холестерола в клетките или организмите може да доведе до увеличаване на възпалителните реакции. Хроничното възпаление е важна връзка между затлъстяването и неговите патофизиологични последици, включително атеросклероза, инсулинова резистентност или развитие на рак 16. HDL може да предпази от развитието на атеросклеротична коронарна болест на сърцето отчасти чрез насърчаване на изтичането на холестерол от макрофаги в артериалната стена. В допълнение, той може да изпълнява противовъзпалителни функции в ендотелните клетки и макрофагите 17. В това проучване ние демонстрираме, че HDL може да потисне индуцираното от вол-LDL натрупване на FC в адипоцитите чрез повишаване на регулацията на SR-BI и впоследствие да предотврати медиирано от вол-LDL въздействие на ER-медиирано възпаление на адипоцитите. За първи път потвърждаваме защитните ефекти на HDL върху възпалението на адипоцитите, което осигурява важна връзка между затлъстяването и неговите усложнения. Нашата констатация също може да даде насоки, че терапевтичните интервенции, като увеличаване на производството или инфузията или подобряване на HDL функцията, могат да прекъснат връзката между натрупването на холестерол и възпалението на мастната тъкан и да имат благоприятни ефекти при пациенти със затлъстяване и метаболитен синдром.,
В заключение, това проучване потвърждава отрицателна връзка между серумния HDL холестерол и провъзпалителните нива на адипокин при субекти със затлъстяване. Ние показахме, че вол-LDL стимулира експресията и секрецията на висфатин и резистин в 3T3-L1 адипоцити чрез активиране на ER стрес. HDL може да потисне индуцираното от вол-LDL натрупване на FC в адипоцитите чрез регулиране на SR-BI и впоследствие да предотврати възпаление на адипоцитите, медиирано от вол-стрес-CHOP, индуцирано от вол-LDL. Това откритие вероятно ще обогати допълнително патофизиологията на адипоцитите и ще обясни благоприятния ефект на HDL върху възпалителни заболявания, свързани със затлъстяването, като диабет или атеросклероза.
методи
елементи
Всички експериментални процедури бяха одобрени и проведени в съответствие с инструкциите на Комитета по етика на Медицинския университет TaiShan. Това проучване на напречното сечение включва селекция от 34 лица, които са имали коремно затлъстяване при възрастни, които са участвали в медицински прегледи в болница за майки и деца в област Daiyue. Всички участници предоставиха писмено информирано съгласие за участие преди записване в проучването.
Коремното затлъстяване (високи триглицериди плюс обиколка на талията [HTGWC]) се определя като триглицериди ≥1,7 mmol/l и обиколка на талията ≥ 90 cm (мъже) и ≥ 80 cm (жени). Изключихме пациенти със сърдечно-съдови заболявания, диабет или понижаващи липидите средства в рамките на 6 месеца преди включване в проучването.
Анализ на серума
Взети са кръвни проби сутрин след пост през цялата нощ. Серумните HDL-C, LDL-C, триглицеридите (TG) и глюкозата се измерват чрез ензимни методи на химичен автоанализатор (Hitachi Co 7600, Токио, Япония). Серумните нива на висфатин, резистин и TNF-a се измерват с помощта на наличния в търговската мрежа комплект Elisa (Bluegene, Шанхай, Китай).
Клетъчна култура
3T3-L1 преадипоцити, закупени от American Type Culture Collection (ATCC), се поддържат в DMEM (GIBCO), допълнена с 10% (v/v) фетален говежди серум (FBS, Gibco), 2 mM L-глутамин и антибиотици. За да се предизвика диференциация на адипоцитите, клетките се култивират в базална среда в продължение на 2 дни и се оставят да растат до сливане и след това се обработват със среда за диференциация, съдържаща 10 μg/ml инсулин, 0,25 μM дексаметазон и 500 μM IBMX (IDI среда) за 2 дни. последвано от инкубация в базална среда, допълнена само с инсулин в продължение на 2 дни. Клетките бяха инкубирани допълнително в базална среда за още 2 дни. По това време повече от 90% от клетките натрупват повече липидни капчици и се постига диференциация на адипоцитите, което се идентифицира чрез оцветяване с маслено червено О. За експеримента клетките се инкубират с DMEM + 0,2% BSA при 37 ° C в продължение на 12 часа и след това се пълни FC чрез инкубация с пълна среда, съдържаща 10 μg/ml ACAT инхибитор 58035 (сигма, САЩ) плюс ox-LDL. за посочените времена.
Изолиране и окисляване на LDL
Човешкият LDL е изолиран и окислен, както е описано наскоро 34. Накратко, LDL (плътност = 1,019 - 1,063 g/ml) се изолира от плазмата на нормолипидемични донори чрез последователно ултрацентрифугиране и се инкубира с 10 mmol/l CuSO 4 в продължение на 18 часа при 37 ° C. След инкубация се добавят 0,1 mmol./1 етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) за предотвратяване на по-нататъшно окисление и окисленият LDL се концентрира до 1 mg/ml. Степента на LDL окисление беше оценена въз основа на повишена подвижност на агарозен гел (в сравнение с естествения LDL) и също така въз основа на повишена концентрация на TBARS в пробата. Ox-LDL препаратите обикновено имат TBARS> 30 μmol/g протеин и относителен индекс на подвижност на агарозните гелове от 2.0-2.5 в сравнение с естествения LDL. Липопротеините се съхраняват при 4 ° С на тъмно и се приготвят прясно на всеки две седмици.
Измерване на нивата на адипокин в средата
Нивата на висфатин и резистин в клетъчната среда бяха открити с помощта на тестови комплекти Elisa (Bluegene, Шанхай, Китай) съгласно инструкциите на производителите.
ER мембранно фракциониране и определяне на свободния холестерол (FC)
Western Blots
Клетъчни или ядрени екстракти се приготвят, както е описано по-рано 36. След това те бяха подложени на Western blot анализ с използване на PDO (Santa Cruz), bip (Abcam), фосфорилиран PERK (Santa Cruz), фосфорилиран eIF2a (Santa Cruz), ATF6 (Santa Cruz), хистон H3 (Abcam), SR-BI ( Novus Biologicals), PDZK1 (Abcam) и β-актин (Sigma) антитела. Протеините се визуализират и определят количествено, като се използва усъвършенстван метод на хемилуминесценция (Pierce) и се определя количествено, като се използва система за изобразяване на хемилуминесценция (Bioshine Chemi Q 4800mini, Шанхай, Китай).
Количествена PCR в реално време
Общата клетъчна РНК се изолира, като се използва реагент TRIZOL (Invitrogen). Синтезът на CDNA се извършва, като се използва MuLV обратна транскриптаза (Applied Biosystems). PCR в реално време се извършва, като се използва SYBR green PCR master mix kit (TianGen Biotech). Праймерите, използвани за PCR в реално време, са както следва: SR-BI Forward ATCTGGTGGACAAATGGAA; SR-BI обратен GAAGCGATACGTGGGAAT; PDZK1 Напред TGACGGTGTGGTGGAAATG; PDZK1 Обратен TGGCAGTAAAGAAGTGGAGAG; GAPDH напред TGACGTGCCGCCTGGAGA AA; Ревизия на GAPDH AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG. Данните бяха анализирани с помощта на софтуер за ротор-ген Q (Qiagen). Относителните нива на иРНК са изчислени по метода 2-DDCt .
Проточна цитометрия
Клетките се оцветяват с 1 μg/ml SR-BI антитяло в продължение на 60 минути. След трикратно измиване в PBS, клетките бяха ресуспендирани в маркирано с FITC анти-заешко антитяло. След инкубация в продължение на 30 минути, клетките се измиват с ледено студен PBS три пъти и след това се анализират на поточен цитометър (BD FACS Calibur).
Малка трансфекция на интерферираща РНК (siRNA)
Клетките се трансфектират със специфични siRNA олигомери (80 nM, Sigma, USA), насочени срещу SR-BI, като се използва Lipofectamine 2000 трансфекционен реагент (Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя. Смесените siRNA олигомери се използват като отрицателна контрола. След трансфекция в продължение на 48 часа, клетките бяха изложени на вол-LDL. Мълчанието на целевите гени беше потвърдено от уестърн блот.
Измерване на ендотоксини
Съдържанието на ендотоксин в изолирания HDL се измерва чрез динамични турбидиметрични методи на бактериален ендотоксинов автоанализатор (TDTF, BET-24A, Tianjin, China).
Статистически анализ
Статистическият анализ беше извършен чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) и едномерни и многовариантни логистични регресионни анализи с GraphPad Prism ver.4.0. Извършени са множество сравнения между групите, използвайки метода на Tukey. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. Стойностите на Р под 0,05 се считат за значими.
Повече информация
Как да цитирам тази статия: Song, G. et al. Липопротеинът с висока плътност инхибира индуцираната от вол-LDL секреция на адипокин чрез увеличаване на регулирането на експресията на SR-BI и потискане на ER стресовия път. Sci. Представител. 6, 30889; doi: 10, 1038/srep30889 (2016).
Допълнителна информация
Word документи
Допълнителна информация
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.