изследване

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Скрининг на протеини и преглед на установени автоантигени
  • Цяло проучване на протеини идентифицира PDILT и MAGEB2 като нови имунни цели
  • Проверка на MAGEB2 и PDILT като основни автоантигени на гонадите
  • дискусия
  • методи
  • Пациентски проби
  • Скрининг на белтъчно поле
  • Статистически анализи
  • Анализи за свързване на радиоактивен лиганд PDILT и MAGEB2
  • Анализ на експресия на PCR с цифрови капчици
  • имунохистохимия
  • Анализ на обогатяването на генната онтология
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителен набор от данни
  • Коментари

елементи

абстрактно

Автоимунният полиендокринен синдром тип 1 (APS1) е моногенно разстройство, характеризиращо се с множество прояви на автоимунно заболяване. Това се дължи на мутации в гена на автоимунен регулатор (AIRE), които насърчават тимичната експресия на хиляди периферни тъканни антигени в процес, критичен за определяне на централната имунна толерантност. Тук използвахме протеомични полета, за да извършим цялостно проучване на автоимунни цели в APS1. Разпитът на въведените автоантигени разкри високо надеждно откриване на автоантитела и чрез изследване на панел от над 9000 протеини, ние допълнително идентифицирахме MAGEB2 и PDILT като новите основни автоантигени в APS1. Нашата оценка на целия протеом разкри значително обогатяване на тъканно специфични имунни цели, отразяващи селективността на AIRE за тази категория гени. Нашите открития също така предполагат, че имунната система при APS1 е насочена само към много ограничена част от протеома, за разлика от широкия дефект в манифестацията на тимуса, свързан с дефицит на AIRE, и повдига нови въпроси относно това какви други фактори са необходими за нарушаване на толерантността.

резултатът

Скрининг на протеини и преглед на установени автоантигени

Изображение в пълен размер

Пациентите с APS1 развиват сложни комбинации от автоимунни прояви. Оценихме корелациите между установени автоантитела, за да разберем по-добре как са взаимосвързани отделните автоимунни отговори. Посочени са автоантитела към два тясно свързани интерферона тип 1; IFNW1 и IFNA1 показват силна корелация (ρ на Spearman = 0.79). По подобен начин наблюдавахме корелации между автоантитела към GAD2 и GAD1 (ρ = 0.70), които са декарбоксилази на глутаминова киселина и се експресират съвместно в островни клетки на панкреаса и произвеждащи гама-аминомаслена киселина (GABA) неврони. Интересното е, че открихме и корелация между TPH1 и DCC (ρ = 0,70), които принадлежат към различни ензимни семейства, но и двете участват в синтеза на моноамини и се експресират в клетки, произвеждащи серотонин в централната нервна система и червата (Фиг. 1в).,

Цяло проучване на протеини идентифицира PDILT и MAGEB2 като нови имунни цели

Оценихме пълен панел от повече от 9000 човешки протеини, за да идентифицираме основните имунни цели при пациенти с APS1. Като първа филтрация изключихме всички цели, които не достигнаха интензитет на сигнала по-висок от 5000 в нито един от изследваните серуми или повече от 2000 в отрицателната проба (поле, изследвано само с реагент за откриване и без серум). За да подберем специфични за пациента сигнали, след това сравнихме честотата на положителните индивиди между пациенти с APS1 и здрава контролна група, използвайки точния тест на Fisher (прекъсване = средно здравословно + 3SD). Сред най-значимите сигнали бяха идентифицирани и изключени редица артефакти на замърсяване по време на печат. Тогава нашият анотиран набор от основни имунни цели при скрининг на протеомично поле включва единадесет интерферона тип 1, други шест известни автоантигена (IL22, TPH1, DDC, GAD1, GAD2 и GIF), трансглутаминаза 4 (TGM4) 32 и три нови кандидат-автоантигени - тестиси експресиран от протеин дисулфид изомераза (PDILT), фамилия меланом B2 (MAGEB2) и MAGEB4 антигени. Сигналите за автоантитела се групират според техните корелати на Спиърман, използвайки пълно йерархично групиране на връзките. Разстояние = 1 - корелация.

Изображение в пълен размер

MAGEB2 и PDILT са идентифицирани като основни имунни цели при скрининг на протеомно поле. MAGEB2 автоантитела са открити при 21 от 51 (41%) пациенти с APS1 автоантитела и PDILT при 19 от 51 (37%) пациенти с APS1, докато те са отсъствали в контролните групи (граница = средно здравословно + 3 SD) ( а ). Анализите за свързване на радиолиганди, мъже с идиопатично безплодие (n = 114), бяха използвани за проверка на MAGEB2 и PDILT автоантитела в откритата кохорта, в репликационната кохорта на 42 пациенти с APS1 и в контролните кохорти, включващи жени с преждевременна яйчникова недостатъчност (n = 114). = 76) и здрави индивиди (n = 91) ( б ). Като цяло автоантитела MAGEB2 са открити при 31 от 92 (34%) пациенти с APS1, при мъже с идиопатично безплодие и при жени с преждевременна яйчникова недостатъчност и липсват при всички здрави контроли. PDILT автоантитела са открити при 28 от 93 (30%) пациенти с APS1 и не са присъствали при всички здрави и всички контролни заболявания (граница = стойност на индекса 15).

Изображение в пълен размер

Проверка на MAGEB2 и PDILT като основни автоантигени на гонадите

Ние проверихме тъканното разпределение на MAGEB2 и PDILT иРНК в панел от единадесет човешки тъкани чрез цифрова капкова PCR. MAGEB2 и PDILT транскриптите са открити при високи нива в тестикуларната тъкан и липсват в негонадни тъкани (Фигура 4а и Допълнителна Фигура S12). За да определим клетъчното разпределение на MAGEB2 и PDILT в тестисите, извършихме имунооцветяване върху човешка тестикуларна тъкан. MAGEB2 белязани с антисерум зародишни клетки на всички етапи на диференциация. PDILT антисерумът е оцветен предимно за подмножество зародишни клетки, разположени в близост до лумена на семенната тръба, съответстващи на клетки от късната диференциационна фаза на сперматогенезата, в съответствие с предишни доклади 34 (Фиг. 4b). Взети заедно, нашите открития предполагат, че MAGEB2 и PDILT са основните автоанатигени на гонадите в APS1.

Разпределението на MAGEB2 и PDILT иРНК беше изследвано в единадесет проби от човешка тъкан чрез цифрова капкова PCR. MAGEB2 и PDILT транскриптите са специфично открити в тестикуларната тъкан ( а ). За да изследваме клетъчното разпределение на MAGEB2 и PDILT в тестисите, извършихме имунохистохимия върху човешка семенна тъкан ( б ). Зародишните клетки, оцветени с MAGEB2-антисерум на всички етапи на диференциация. Наблюдава се и неспецифична ядрена позитивност. PDILT-антисерумът е оцветен предимно върху подмножество зародишни клетки, разположени близо до лумена на семенната тръба. Включен е отрицателен контрол, ако първичното антитяло е оцветено.

Изображение в пълен размер

дискусия

APS1 има многоорганен автоимунитет и автоантитела отговори срещу различни тъкани. Въпреки че в отделни проучвания са дефинирани няколко имунни цели, автоимунната експресия на APS1 все още не е обхваната изчерпателно. В това проучване ние оценихме B-клетъчния отговор срещу група от над 9000 човешки протеина, за да позволим подробно профилиране на известни автоантигени и да идентифицираме нови имунни цели в APS1. Преглед на няколко установени автоантигени разкри изключително силно откриване на автоантитела и чрез изследване на цялото поле, ние допълнително идентифицирахме два нови автоантигена, MAGEB2 и PDILT, които могат да бъдат потвърдени чрез независими методи и в кохорта за репликация.

Проучванията върху APS1 и неговия животински модел хвърлят светлина върху процеса, чрез който имунната система се научава да се самоотчита 12. Остава обаче непълно да се разбере как централният дефект на толерантност при дефицит на AIRE се превръща в автоимунни отговори, тъй като преди това не са провеждани всеобхватни проучвания на автоимунни цели при пациенти с мишки с дефицит на APS1 или Aire. Нашата широка характеристика на B-клетъчните цели предоставя нови средства за оценка на тези събития.

Трябва да бъдат разгледани няколко обяснения защо автоимунният отговор изглежда е с порядък по-ограничен, отколкото би се очаквало от дефект в AIRE-зависимото представяне на антигена. Първо, трябва да се признае, че разпознаването на антигени зависи от MHC и се очаква само подгрупа от самоантигени да имат необходимите изисквания, за да бъдат представени ефективно на MHC и да предизвикат силни имунни реакции. Трябва да се имат предвид и потенциалните ефекти от механизмите за толерантност на В-клетките и периферните толерантности, които могат да осигурят допълнителни филтри за развитието на автоимунни отговори. Последните проучвания при пациенти с APS1 също изясниха ролята на периферната антигенна презентация в автоимунните прояви 32. Установено е, че автоантитела към специфичния за простатата ензим се развиват само при мъжете и едва след възрастта на узряването на простатата в пубертета е необходимо индикация за експресия на периферен антиген за развитието на автоимунен отговор. Този рядък пример за полов диморфен автоантиген предполага, че AIRE-зависимите гени трябва да бъдат експресирани в периферията на достатъчно ниво, за да предизвикат отговори на автоантитела.

Също така изследвахме дали автопротигените на APS1 споделят части от функционалните характеристики, които са специфични за тъканите, и търсихме прекалено представени генни онтологични термини сред основните имунни цели на екрана. Най-често използваният онтологичен термин се отнася до метаболизма на аминокиселини и производни и сигнализирането на клетъчните клетки. Термините биосинтез на невротрансмитер и свързване на витамини са обогатени сред имунните цели (вж. Допълнителна таблица S3).

Ние идентифицираме MAGEB2 и PDILT като нови основни автоантигени в APS1. Интересното е, че както MAGEB2, така и PDILT се експресират специфично в зародишните полови клетки. MAGEB2 е член на генно семейство, групирано в дозозависим регион на чувствителния полов оборот на Х хромозомата и се експресира в тестикуларната тъкан, както и в различни тумори35. PDILT е специфичен за тестисите протеин, който показва хомология с дисулфидни изомерази 33, 34, 41. PDILT функционира в комплекс от специфични за зародишните клетки шаперони, който е от съществено значение за мъжката плодовитост 41. По-специално, въпреки очевидната експресия, специфична за тестисите, автоантителата MAGEB2 и PDILT присъстват както при мъже, така и при жени с APS1. Това наблюдение, заедно с опита с простатния автоантиген в APS1 32, повдига въпроса дали MAGEB2 и PDILT могат да бъдат експресирани и в женските тъкани. Гените MAGEB наистина се експресират в женските зародишни клетки и изглежда играят важна роля в женската гаметогенеза 36. Счита се, че много гени с очевидна експресия, специфична за тестисите, се експресират и в женските зародишни клетки, а експресията на ооцитите лесно се пренебрегва при анализ на грубата тъкан на яйчниците. .

Експресията на MAGEB2 и PDILT за половите жлези повдига въпроси дали тези антигени могат да играят роля при APS1 безплодие. Безплодието е често срещано както при мъжете, така и при жените с APS1 8. Женското безплодие в повечето случаи се обяснява с преждевременна яйчникова недостатъчност и автоимунитет срещу яйчникови клетки, произвеждащи стероиди. Наскоро автоимунитетът на простатата беше идентифициран като основна проява на APS1 с потенциална роля в развитието на мъжкото безплодие 32. Идентифицирането на MAGEB2 и PDILT разкрива зародишните зародишни клетки като основни имунни цели в APS1 и описва още един автоимунен компонент, който потенциално може да допринесе за безплодие при мъже и жени с APS1.

методи

Пациентски проби

Всички пациенти са дали информирано съгласие за участие.

Скрининг на белтъчно поле

Проучването и сканирането на протеинови полета (ProtoArray® v5.0 PAH0525020, Life Technology) се извършва съгласно протокола за профилиране на имунния отговор Invitrogen BioMarker, като се използва препоръчаният реагент за откриване (Alexa Fluor® 647 Goat anti-human IgG A21445, Invitrogen) и блокиращ буфер ( блокиращ буфер) буферен комплект PA055, Invitrogen). Полетата бяха изследвани със серум при разреждане 1: 2000. Полетата бяха сканирани с помощта на скенер за микрочипове GenePix 4000B и софтуерът за микрочипове GenePix® Pro (v6.1) беше използван за подравняване и събиране на данни.

Статистически анализи

Статистическият анализ на данните от протеомното поле е извършен при логарифмично трансформирани интензитети. Точният тест на Fisher е използван за класифициране на целите на протеиновите полета, които се различават между пациента с APS1 и здравата контролна група. Сигнал се счита за положителен, ако стойността на интензивността е над средното здравословно + 3SD.

Анализи за свързване на радиоактивен лиганд PDILT и MAGEB2

Автоантителата към PDILT и MAGEB2 се измерват с помощта на тестове за свързване на радиолиганда. Човешки кДНК клонинги за PDILT (SC306958, Origene, номер за присъединяване NM_174924) и MAGEB2 (SC122625, Origene, номер за присъединяване NM_002364) бяха клонирани в експресионния вектор pTNT (L5610, Promega) и транскрибирани и транслирани in vitro в присъствието на 35 S метионин TNT системи). Имунопреципитацията се провежда в 96-ямкови филтриращи плаки (Millipore). Положителен стандарт, APS1 пациентски серум с известна реактивност и отрицателен стандарт, 4% BSA, бяха включени във всяка плака. 30 000 CPM на радиомаркиран протеин и 2,5 μl серумна проба бяха добавени към всяка ямка. Всички серуми бяха анализирани два пъти. Серумните антитела бяха имобилизирани до протеин А Сефароза (nProtein A Sepharose TM 4 Fast Flow, GE Health Care) по време на инкубация през нощта. Радиоактивността се измерва в микро-бета брояч (1450 Microbeta Trilux, Wallac). Стойностите на индекса на автоантитела се изчисляват по следния начин: (пробна стойност/отрицателна стандартна стойност)/(положителна стандартна стойност/отрицателна стандартна стойност) × 100.

Анализ на експресия на PCR с цифрови капчици

Общата РНК от Origene беше преобразувана в cDNA с помощта на двойно верижен cDNA Synthesis Kit на Life Technologies и протокола с произволни хексамери (N8080127, Life Technologies) за синтеза на първата верига. Използва се супермикс ddPCR за сонди на Bio-Rad (186-3040, BioRad) и се провежда генериране на капчици съгласно стандартния протокол на BioRad със сонди TagMan към PDILT и MAGEB2 и β2M като контрола (1206926, 4351372 и 4448489, Life Technologies). Пробите се изпълняват на машина Quantalife ddPCR и софтуерът Quantasoft е използван за събиране и анализ на данни.

имунохистохимия

Оцветяването за MAGEB2 и PDILT се извършва върху фиксирана във формалин парафин, вградена човешка тестикуларна тъкан, като се използва Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific). Плъзгащите се тъкани първо се инкубират с Ultra V блок (TA-125-UB, Thermo Fisher Scientific, Inc.) за 5 минути, а след това се инкубират с анти-MAGEB2 (49-718, ProSci) при разреждане 1: 1750 или анти- PDILT (HPA041923, Sigma) при разреждане 1: 1000 за 30 минути. След това предметните стъкла се инкубират с маркиран хрян-пероксидаза-полимер в продължение на 30 минути, последвано от разтвор на 3,3-диаминобензидин (DAB) за 2 × 5 минути. Слайдовете се оцветяват в Mayers хематоксилин (01820, Histolab) в продължение на 5 минути с помощта на Autostainer XL (Leica) и след това се изплакват в литиева карбонатна вода (разредена 1: 5 от наситен разтвор) за 1 минута. Слайдовете бяха дехидратирани в степенуван етанол и накрая покрити (PERTEX, Histolab) с помощта на автоматизирана стъклена покривна пантофка (CV5030, Leica). Слайдовете бяха сканирани с помощта на автоматизираната система за сканиране Aperio XT (Aperio Technologies).

Анализ на обогатяването на генната онтология

За да намерим статистически свръхпредставени генни онтологични термини (база данни GOa-човек), присвоени на установените автоантигени, присъстващи в масива, използвахме онлайн софтуера GOstat 45. За да се избегне изцяло интерфероните да надменят другите гени в анализа на обогатяване на термина GO, интерфероните бяха представени само от IFNA13 и IFNW1.

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Landegren, N. et al. Проучване в целия протеом на автоимунния целеви репертоар при автоимунен полиендокринен синдром тип 1. Sci. Представител. 6, 20104; doi: 10.1038/srep20104 (2016).

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителен набор от данни

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.