елементи

абстрактно

Малина (Rubus ideaus L.) е деликатен плод с изключително кратък срок на годност. Той е богат източник на здравословни съединения като антоцианини. Бърз спад на качеството на плодовете обикновено се случва поради разпадане и физиологично разграждане, което е свързано със загуба на мембранната цялост, водеща до прогресиране на стареенето и стреса. 1 Фосфолипаза D (PLD), фосфолипиден разграждащ ензим, е ключов ензим, участващ в инициирането на каскада от катаболни събития, които водят до възможно увреждане на мембраната и е силно активен в плодовете на други плодове, като ягоди. 2, 3

Подходящите технологии и методи за увеличаване на трайността след прибиране на реколтата са високи. Прилагането на хексанал като препарат, преди или след прибиране на реколтата, показва обещаващи резултати при увеличаване на срока на годност на няколко плодове, зеленчуци и цветя. 4, 5, 6 Биохимичните и генетични изследвания на омекотяването на плодовете показват, че обработката на клетъчната стена е резултат от координираната експресия на няколко семейства гени, кодиращи протеини, свързани с метаболизма на клетъчната стена, включително експанзини, пектин метилестерази, полигалактуронази, пектат лиази β-галактозидаза, αL-арабозидаза ендо- (1,4) -β-D-глюканази, р-ксилозидази, ксилоглюканази, ендотрансглюкозидази, ендо-мананази. 7, 8, 9, 10, 11 Въпреки това, усилията за потискане на експресията на ензимите, разграждащи клетъчната стена чрез генно инженерство, не осигуряват задоволителни резултати за ефективно предотвратяване на омекотяването на плодовете. 12, 13

От калциево-свързващите протеини анексините образуват семейство структурно свързани протеини, които проявяват калциево-зависимо фосфолипидно свързване. Анексините са разтворими протеини, способни да свързват Са 2+ или независимо да се свързват с мембранни фосфолипиди. Последователността на генома показа, че анексините в растенията включват малка група мултигени с няколко члена, осем в групата Arabidopsis thaliana 28 и девет в групата Oryza sativa. Повишената експресия на някои анексини при специфични проблеми в развитието или околната среда ги свързва със сигнализирането на Ca 2+ по време на нодулация, 30 ABA 31, 32 реакции или студена аклиматизация. Възможността анексините да образуват Ca 2+ канали, заедно с тяхното присъствие в кореновите косми и зоната на удължаване на корена, предполага роля в производството на повишената цитоплазмена концентрация на калций ([Ca 2+] cyt), необходима за растежа или удължаването на върха. Установено е, че растителните анексини имат активност на ATPase и GTPase in vitro. 22, 34 AtANN1 е идентифициран in vitro като ATP свързващ протеин. 35

Нашето предишно проучване анализира ефекта на хексанал върху относителните нива на транскрипция на редица гени, които е вероятно да бъдат свързани с ензимите, разграждащи клетъчната стена в ягодите. 36 В това проучване ние съобщаваме, че механизмът на действие на хексанал се забавя при забавяне на увреждането на мембраната и удължаване на срока на годност, използвайки мултидисциплинарни подходи, включително физиологични, хистологични и биохимични характеристики. Експресионните модели на трите гена на фосфолипаза D, пет членове на анексин гена и четири калмодулин-свързващи транскрипционни активатори са количествено определени чрез qRT-PCR по време на развитието на плодовете и узряването в отговор на хексанални приложения. Бяха извършени сканираща електронна микроскопия, както и енергодисперсионна рентгенова спектрометрия, за да се анализират структурните и композиционни детайли на третирани и необработени плодове. В допълнение, активността на фосфолипаза D е тествана по време на развитието на плодовете и шест дни след прибиране на реколтата след хексанални приложения.

резултатът

Физико-химични свойства

Ефектът на хексанала върху качеството на плодовете и физиологичните параметри, които определят свойствата на трайност на плодовете на малина, са показани в таблица 1. Както се очаква, TSS се увеличава с наближаването на зрелостта на плодовете и през целия период на съхранение, както между третирани, така и необработени плодове (таблица 1 ). ). Въпреки това, TA е относително по-висок при прибиране на реколтата и постепенно намалява с предварително съхранение. Статистическият анализ не показва значителен ефект от приложението на хексанал върху TA или TSS. По време на 6-дневния период на съхранение, количеството на загуба на тегло е значително по-ниско в третираните плодове след втория и третия ден след прибиране на реколтата, след което се връща към подобно съотношение в третираните и контролните плодове през оставащия период на съхранение (Таблица 1) . Въпреки незначителния ефект на хексанал върху феталната загуба на тегло, общата загуба на тегло по време на съхранение е 30,2% за нетретирани плодове в сравнение с 25,9% за третирани плодове (Таблица 1).

Маса в пълен размер

Силата на засмукване на плода, силата на опън, необходима за отстраняване на зрънцето от контейнера, беше измерена и използвана като индикатор за омекотяването на плодовете. Прилагането на хексанал значително увеличава якостта на опън на третираните плодове в сравнение с контролата (Фигура 2). Всички плодове показват непрекъснато намаляване на якостта на опън при последващо съхранение при 20 ° C, но степента на загуба е значително по-ниска при третираните плодове в сравнение с контролата през първите 4 дни от периода на съхранение. През първите четири дни след третирането след прибирането на плодовете се изискваше значително по-голямо количество сила за изваждане на плодовете от контейнера (1, 96–1, 49 N) в сравнение с контролата (1, 76–0, 98 N ) (Маса 1). Не се наблюдава значителна разлика през последните два дни след събирането. При полеви условия беше много забележимо контролните плодове да паднат на земята, докато обработеният хексанал остава прикрепен и все още изисква минимална сила, която трябва да се отдели от техните контейнери (Допълнителна фигура 1).

хексанал

Якост на опън в контролни и третирани с хексанал (HC) малини в продължение на шест дни след беритбата. Всяка стойност представлява средната стойност от двадесет и пет измервания на силата на опън, необходима за отстраняване на контейнерите от плодовете им. Звездичките показват значителни разлики между контрола и лечението с хексанал по едно и също време на съхранение (P = 0,05).

Изображение в пълен размер

Беше извършен анализ на сканиращ електронен микроскоп (SEM), за да се разберат по-добре механизмите, залегнали в корелацията между приложението на хексанал и увеличеното задържане на плодове. Този анализ показва обилно натрупване на епидермални косми на върха на третираните плодови съдове, докато не се наблюдават епидермални косми на върха на нетретираното животно (Фигура 3). Епидермалната коса присъства в подобни количества въз основа на обработени и контролирани контейнери за плодове.

Хистологични наблюдения на контейнери с малина с помощта на SEM анализ. ( а, ° С а д ) представляват контрол, докато ( б, д а е ) представляват плодове, третирани с хексанал (HC). ( д а е ): по-голямо увеличение на върховете на контейнери, които показват изобилна епидермална коса върху третирания хексанал ( е ), без епидермални косми, наблюдавани в контролните контейнери за плодове ( д ). Скалата е 500 μm.

Изображение в пълен размер

Генна експресия, променена от хексанал

Експресионните модели на три гена на фосфолипаза D, пет гена на анексин и четири калмодулин-свързващи транскрипционни активатори са количествено определени по време на развитието на плодовете и узряването в отговор на приложението на хексанал. Петима членове на групата на анексините показаха постоянно нарастване на нивата на транскрипт на всички етапи от развитието на плодовете. (Фигури 4а - д). Всички анексинови гени показват една и съща тенденция с по-висок размер за Ann2 и Ann5. Този модел е често срещан сред лекувани и нелекувани плодове, но хексаналът значително повишава нивото на Ann3 транскрипт в средния и късния стадий на развитие (Фигура 4в). Анализът на данните за експресията на четирите члена на калмодулин-свързващия транскрипционен активатор показа, че техните нива на транскрипт достигат връх в средния етап от развитието на плодовете и след това намаляват (Фигури 4f-i). Третираните с хексан плодове не показват отговор, с изключение на значително по-голямо увеличение за средния и късния стадий на cAMTA3 и късния стадий на cAMTA5 (фигури 4g и i).

Схемата на експресия на транскрипт, измерена чрез qRT-PCR на пет членове на гена на анексин ( а - д ), четири активатора на транскрипция, свързващи калмодулин ( е - i ) и три гена на фосфолипаза D ( j - л ) по време на развитието на малинови плодове. Експресията е определена в сравнение с три домашни гена (His3, GPDH и Actin). Данните представляват средната стойност (± стандартно отклонение, sd) на четири биологични повторения, всяка с три технически повторения. Статистически значимите разлики от контрола (Cont) и хексанала (HC) на същия етап от развитието на плодовете са маркирани (*) за нивата на вероятност (P

Хексаналните приложения променят нивата на транскрипт на няколко гена, участващи в узряването на малиновите плодове. Транскриптите са оценени чрез qRT-PCR на пет членове на гена на анексин ( а - д ), четири активатора на транскрипция, свързващи калмодулин ( е - i ) и три гена на фосфолипаза D ( j - л ) в продължение на шест дни след събирането. Всички плодове се съхраняват при 20 ° C до вземане на проби. Данните представляват средната стойност (± sd) на четири биологични повторения, всяка с три технически повторения. Данните за експресията бяха нормализирани с помощта на три поддържащи гена (His3, GAPDH и Actin). Статистически значимите разлики от контрола (Cont) и хексанал (HC) в същия ден след събирането са маркирани (*) и (**) за нивата на вероятност (P

Структурни наблюдения на плодови макаронени плодове от малина чрез SEM-EDS анализ. Сравнение на епидермални косми от плодови пулпи, третирани с хексанал ( а ) и контролирайте плодовете ( б ) в техния среден етап на развитие. ( ° С ) показва по-голям увеличен изглед на силно локализираните структури за отлагане на кристали, наблюдавани върху третирани пияни епидермални косми. д ) показва изходните данни, генерирани от графики на оригиналния спектър на EVS анализ. Всяка стойност представлява средната стойност от дванадесет проби. EDS анализът е извършен върху нетретирани плодове (Контрол), HC- ( д ): третиран с хексанал със структура на отлагане, HC-ND: хексанал, третиран в некристалната област. Звездичките показват значителни разлики в нивата на калций (P ⩽ 0, 01).

Изображение в пълен размер

SEM анализ, показващ вътрешната структура на макаронени плодови макарони. а) аб ): контролен плод, ° С а д ): плодове, третирани с хексанал. Снимките са правени при плодове в средната фаза. Не се наблюдава разлика във вътрешната структура на плодовете поради хексанални апликации. Положението на семената и ставите между костилките е показано на фигурите ( ак ).

Изображение в пълен размер

В заключение, ефектът от хексанала върху промяната в структурата на плодовете зависи от етапа на развитие и изключително върху екзокарпите и епидермалната коса.

Промени в активността на PLD по време и след развитието на плодовете

За да се оцени потенциалната роля на хексанала в инхибирането на фосфолипаза D и удължаването на срока на годност, активността на PLD е тествана на различни етапи от развитието на плодове от малина. В този колориметричен анализ фосфатидилхолинът се превръща в холин чрез PLD, където холинът след това се окислява от холин оксидаза. Интензитетът на оцветения реакционен продукт е пряко пропорционален на активността на PLD в пробата.

Част от обяснението за това увеличаване на задържането на плодове е намерено чрез SEM анализ, който показва изобилие от епидермални власинки по върховете на обработени плодови контейнери, като по този начин увеличава връзката между плодовете и неговите контейнери, като по този начин увеличава силата, необходима за отстраняване на контейнера за плодове .

Установено е, че чувствителните към калций протеини, наречени калмодулини, регулират разширяването и узряването на доматите. 50, 51 Една от важните констатации на изследването от Yang et al. 51 беше, че потискането на калмодулиновите гени може да бъде критично за започване на независим от етилен процес на зреене. В това проучване експресията на трите калмодулин-свързващи транскрипционни активатора (cAMTA1, cAMTA4 и cAMTA5) е диференцирано променена в отговор на приложението на хексанал, което усилва следите от потенциалния ефект на хексанала върху калциево-свързващите протеини, които действат като сигнални сензори.

Нашите проучвания също демонстрират ясна връзка между активността на PLD и експресията на гена PLD на различни етапи от развитието на плодовете на малина, както и по време на съхранението. Подобен анализ беше извършен с използване на нормален и антисмислен PLD в домати „Celebrity“. Тези резултати убедително показаха, че експресията на PLD е намалена по време на узряването на плодовете чрез въвеждане на антисмислена PLD алфа cDNA в домати „Celebrity“. Лечението с хексанал причинява ясно инхибиране на активността на PLD в плодовете на малина по начин, подобен на антисмислените PLD линии на домати, показва намалени нива на активност на PLD. В същия доклад е установено, че микрозомалната активност на PLD в плодовите мембрани на ягоди се стимулира от калций. Тези резултати, заедно с нашите резултати, показват ясна връзка между приложението на хексанал, клетъчното стимулиране на калция и инхибирането на активността на PLD. Пълната последователност на събитията за предаване на сигнала, включени в тази връзка, изисква допълнително проучване.

Въпреки че малините изглеждат много чувствителна система за приложение на хексанал, явлението предкожно третиране с хексанал изглежда много важно, за да се модулира инхибирането на PLD и да се постигне оптимален ефект. Например, хистологичните наблюдения показват, че отлагането на калций се извършва само когато плодовете се третират на техния междинен етап на развитие. Мисран и др. 39 също така посочи, че етапът на приложение на плодовете е от решаващо значение, тъй като инхибирането на PLD има много малък ефект, когато мембраната започне да се влошава и започват катаболните липидни каскади. Например, доматените плодове се третират в зряла зелена фаза, за да се постигнат най-добри резултати по отношение на цвета и развитието на вкуса. Тъй като плодовете като череши трябва да се третират приблизително 15 дни преди прибиране на реколтата, за да се увеличи максимално срокът им на годност от 30 дни при 4 ° C.

В заключение, тази работа ясно демонстрира важната роля, която хексаналът може да играе за намаляване на нивата на транскрипт и активността на PLD, както и за промяна на някои протеини, свързващи калция, които функционират като сигнални сензори. По този начин приложението на хексанал може да бъде желана и подходяща технология за увеличаване на срока на годност на малини след сгъване при изключително нетрайна светлина. Хексаналът, въпреки химически наклоненото си наименование, е естествено съединение, което всички растения произвеждат като летлив защитен механизъм. Това е и GRAS (обикновено считано за безопасно) съединение, одобрено от FDA като хранителна добавка. 52 Тези две характеристики трябва да облекчат всякакви опасения, които потребителите могат да имат, когато ги използват върху годни за консумация продукти като малини. Също така би било интересно да се определи дали натрупването на калций поради прилагането на хексанал влияе върху ядливото качество и вкуса на плодовете. По-нататъшни проучвания могат да бъдат използвани за разработване на разбиране на биохимичния механизъм на взаимодействието между хексаналния и междуклетъчния калций в цялостната регулация на PLD при удължаване на срока на годност на плодовете.