елементи

абстрактно

Ентералното хранене с краве мляко е свързано с неонатален некротизиращ ентероколит (NEC) и сепсис. Хранителната антигенна сенсибилизация може да играе роля за насърчаване и/или поддържане на възпалението и при двете състояния. За да се изследват специфичните за цитокините отговори на протеини от краве мляко (CMP) при недоносени бебета с NEC и сепсис, бяха допуснати 14 бебета с NEC, 14 консенсусни здрави контроли и 10 септични контроли. Нестимулирани и стимулирани мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC), секретиращи IFN-γ, IL-4, IL-10 и TGF-β1, бяха преброени чрез едноклетъчен ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISPOT). По време на острата фаза на NEC пациентите показват общ модел на високи нива на секреция на цитокини, когато не се стимулират и стимулират от митогени [фитохемаглутинин (PHA)] и CMP: бета-лактоглобулин (β-Ig) и казеин. Тези отговори са по-изразени при β-Ig за IFN-γ, IL-4 и IL-10, отколкото TGF-β1. Цитокиновите отговори при сепсис са по-ниски, отколкото при NEC (най-ниски при здрави контроли с минимален отговор на TGF-β1). С течение на времето се индуцират по-ниски честоти на клетки, секретиращи цитокини, отколкото по време на острата фаза, с изключение на клетките, секретиращи TGF-β1, които се увеличават с продължителност (в отговор на PHA и CMP) главно след NEC, но също и след сепсис.

регулаторни

Основното

Некротизиращият ентероколит при новородените (NEC) и сепсисът са сред най-честите усложнения при NICU (1). И в двата случая честотата на заболяването е обратно пропорционална на теглото при раждане и GA (2). NEC представлява хетерогенна група чревни заболявания, която включва спектър от клинични прояви и различна степен на чревно възпаление (3). Патогенезата на NEC се счита за многофакторна, но не е напълно изяснена. Идентифицирани са няколко предразполагащи фактора, включително преждевременна консумация, хранене с мляко, чревна хипоксия/исхемия и бактериална транслокация. NEC обикновено се среща при недоносени бебета (4), които също са особено склонни към сепсис (5).

Повечето случаи на NEC се наблюдават при деца с ентерално хранене. Изглежда, че естеството на ентералното хранене е важен патогенен фактор. Епидемиологичните проучвания показват повишен риск от NEC при кърмачета, хранени с краве мляко, в сравнение с тези, които получават кърма (майка или донор) (6). Потенциалната връзка между NEC и млякото на млечна основа досега е изследвана най-вече чрез идентифициране на имунопротективни елементи в кърмата и определяне на ефекта на типа мляко (адаптирано мляко или гърда) върху развитието на чревна микробиоза (7) Бета-лактоглобулинът (β-Ig), за който не е известно, че обикновено съществува в човешкото мляко, представлява 8,5% от протеиновия състав на протеините на кравето мляко (CMP), докато казеините представляват 80% от CMP (8).

Въпреки че имунната система на недоносените бебета се счита за относително „незряла“ в сравнение с имунната система на възрастни бебета, недоносените деца могат да реагират по подходящ начин на антигенни стимули. Въпреки това, малко се знае за имунологичните отговори на тези деца към диетични антигени (9), било то в „здравословно“ състояние, или може би по-важното, при болестни състояния, които могат да включват лигавична бариера като NEC и сепсис.

По-рано сме демонстрирали сенсибилизация към CMP при деца с NEC, където in vitro стимулация на мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) с казеин и β-Ig индуцира ефекторна реакция и на двата типа Т хелперни клетки (Th): Th1 (IFN-γ) ) и Th2 (IL). -4 и 5) (10).

В това проучване ние използвахме чувствителния ензимен метод имуноспот (ELISPOT), който позволява откриването на секреция на цитокини на ниво единична клетка, и допълнително изследвахме това явление. Бяха оценени деца с NEC, здрави контроли и кърмачета със сепсис. В допълнение към повторното изследване на секрецията на IFN-y и IL-4, ние също така характеризираме регулаторните цитокини IL-10 (секретирани от Th тип 1 регулаторни клетки) и TGF-β1 (секретирани от Th3) от PBMCs. В допълнение, повторихме всички оценки в момента, в който новородените се възстановиха от NEC и сепсис в сравнение със здрави контроли, за да измерим промените в отговорите на цитокините с течение на времето.

ПРЕДМЕТИ И МЕТОДИ

Субекти.

Тридесет и осем недоносени деца, приети в NICU в болница Челси и Уестминстър между февруари 2006 г. и август 2007 г., бяха приети в три проучвателни групи: 14 недоносени бебета с NEC [модифициран Бел (11) степен II: осем случая и степен III: шест случая] които са били идентифицирани и получени в рамките на 24 часа след поставяне на диагнозата; 14 здрави контролни пациенти без анамнеза за NEC или сепсис, които са били индивидуално коригирани за паралелен подбор за постконцептивна възраст (PCA) и постнатална възраст (PNA) спрямо пациенти с NEC; и 10 новородени с късно начало (> 1 годишна възраст) положителна сепсисна кръвна култура (септични контроли), съответстващи, макар и не индивидуално, на PCA и PNA на пациенти с NEC и здрави контроли.

PBMC изолация.

Приблизително 0,5 ml хепаринизирана кръв бяха събрани от кърмачета в три групи при диагностициране и след това при термин. PBMCs бяха изолирани чрез центрофугиране с градиент на плътността при използване на стандартни процедури. Клетките се промиват в пълна среда (R10), съдържаща RPMI 1640 7 (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Gillingham, UK), 50 U/ml пеницилин, 50 ug/ml стрептомицин, 10 ug/ml гентамицин, 2 mm глутамин, натрий. пируват, 10 mmol 4- (2-хидроксиетил) -1-пиперазинетансулфонова киселина буфер (HEPES) и 10% топлинно инактивиран FCS. Концентрацията на PBMC се определя, като се използва брояч на частици Z1 (Beckman Coulter, High Wycombe, UK). Процентът на жизнеспособните клетки се определя чрез секреция на трипан синьо.

Покрийте плочата с улавящи антитела.

Нитроцелулозна дънна микротитърна плоча (MAIPS 4510; Millipore, Watford, UK) беше предварително навлажнена с 20 μl/ямка 70% етилов алкохол за 5 минути при стайна температура. Алкохолът се декантира и ямките се промиват три пъти с 200 μl PBS и се покриват със специфично за цитокините моноклонално улавяне на антитяло в 100 μl PBS (1 μg/гнездо за IFN-γ, IL-4 и IL-10 и 0,3 μg/гнездо ). за TGF-р1). Плаката се инкубира поне за една нощ и до 1 седмица при 4 ° С в запечатана торба. Непосредствено преди употреба, неадсорбираното антитяло се декантира и ямките се промиват три пъти с PBS и се блокират с 200 μl/ямка R10 за 2 часа при 37 ° С в 5% СО2 овлажнена атмосфера.

Инкубация на PBMC.

Блокиращата среда се декантира и се добавят РВМС при 0,5 х 105 клетки на гнездо в три екземпляра за всеки стимул. Клетките се инкубират в продължение на 20-24 часа в атмосфера от 5% CO 2, при 37 ° C в отсъствието или наличието на подходящи антигени или митогени: Хемоцианин на лимфен отвор (KLH; 500 μg/ml), β-Ig (500 μg/ml), казеин (500 μg/ml) и фитохемаглутинин (PHA; 10 μg/ml; Sigma Chemical Co.-Aldrich).

Откриване на клетки, секретиращи цитокини.

Ямките се промиват шест пъти с PBS, съдържащ 0,05% Tween 20 (200 μl/ямка; Sigma Chemical Co.). 0.4 μm филтрирано биотинилирано цитокин-специфично моноклонално антитяло (MAb) беше добавено в 100 μl обеми/гнездо (0.1 μg/гнездо, разредено в PBS/0.5% BSA) и инкубирано в продължение на 4 часа при стайна температура.

Улавянето и откриването на MAb върху IFN-γ и IL-4 са получени от MAbtech AB (Nacka Strand, Швеция), докато антителата срещу IL-10 от BD Biosciences (Сан Диего, Калифорния) и тези върху TGF-β1 са получени (Ab: улавяне на рекомбинантна човешка TGF-βRII/Fc химера и биотинилирано анти-TGF-β1 антитяло) са получени от R&D системи (Обединеното кралство). В края на инкубационния период ямките се промиват шест пъти с PBS/0,05% Tween 20 и се добавя 100 μl авидин-биотин-пероксидазен комплекс (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA), приготвен съгласно инструкциите на производителя. 1-2 часа при стайна температура. Ямките се промиват три пъти с 200 μl PBS/Tween 20, след това три пъти с 200 μl PBS и накрая към всяка ямка се добавят 100 μl аминоетилкарбазолов субстрат (AEC) (Sigma Chemical Co.-Aldrich). Петното се развива при стайна температура в продължение на 4 минути, преди да се измие с чешмяна вода и да се изсуши една нощ. Петната бяха преброени с помощта на четец за плочи ELISPOT (Carl Zeiss, Welwyn Garden City, Великобритания). Крайните резултати бяха изразени като оцветени клетки (SFC) на 105 PBMC.

Статистика.

Данните във всяка от трите групи бяха тествани за нормалност на разпределението и бяха установени, че са непараметрични. Различни набори от анализи изследваха четири разлики в цитокиновия отговор във всяка група както в остра, така и в срочна форма. Резултатите се изразяват като медиана и интерквартилен диапазон (IQR) за всяка група или като брой и процент. Сравненията между новородени с NEC и здрави контроли бяха анализирани като сдвоени данни (сдвоен тест на Wilcoxon) за сравнение между срочни и остри проби. Сравненията със септични деца не бяха сравнени (тест на Ман-Уитни). Нивото на същественост е определено на 1%; само р сепсис; р сепсис; р сепсис; 4-10 пъти; p 5-кратно увеличение; Фиг. 1).

Повишени честоти на PBMC - секретиращи цитокини при пациенти с NEC, септични контроли и здрави контроли (AELISPOT) след p - Ig стимулация при представяне (остра) и по време (срок). Честотите на IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) и TGF-β1 (D) секретиращи клетки се изразяват като AFCS при 105 MNC (ASFC при 105 PBMC), представляващи разликата между средният брой петна в третирани с антиген кладенци и кладенци в нестимулирани ямки на всеки етап на вземане на проби. Всеки ред представлява една тема. * р сепсис, 3-5 пъти; p 5-кратно увеличение; Фиг. 2). Стимулиране с KLH индуцира незначителни отговори във всички проби (NEC, сепсис и здрави контроли при представяне и в срок за четирите оценени цитокини).

Повишени честоти на PBMC-секретиращи цитокини при пациенти с NEC, септични контроли и здрави контроли (AELISPOT) след казеинова стимулация, при представяне (остра) и по време (срок). Честотите на IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) и TGF-β1 (D) секретиращи клетки се изразяват като AFCS при 105 MNC (ASFC при 105 PBMC), представляващи разликата между средният брой петна в третирани с антиген кладенци и кладенци в нестимулирани ямки на всеки етап на вземане на проби. Всеки ред представлява една тема. * p β-lg