инхибитор

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Chaetocin подобри прогнозата при плъхове, чувствителни на Dahl сол (DS) със сърдечна недостатъчност
  • Четоцинът възстановява регулирането на митохондриалните гени, свързани със сърдечна недостатъчност
  • Хетоцинът подобрява митохондриалното дишане и увеличава митохондриалното съдържание в неуспешни сърца
  • Сърдечната недостатъчност повишава нивата на H3K9me3 върху повтарящи се елементи и този ефект е обърнат след лечение с хетоцин.
  • Chaetocin намалява нивата на H3K9me3 при повторения на интрон Pgcla
  • GO анализ на обърнати с хетоцин повтарящи се H3-нагоре H3K9me3 локуси
  • дискусия
  • Материали и методи
  • Доставка на животни и лекарства
  • Кръвно налягане и ехокардиографски изследвания
  • Морфометричен анализ
  • Количествена количествена полимеразна верижна реакция (PCR)
  • ДНК микрочипове
  • Чип
  • последователност
  • Промяна на нивото H3K9me3 на повтарящи се елементи
  • Изолиране на сърдечни митохондрии
  • Потреблението на кислород в митохондриите
  • Съдържание на митохондриални протеини и ДНК
  • Статистически анализ
  • Хранилище за данни
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Сърдечен арест
  • Пост-транслационни модификации на Histone

абстрактно

Ацетилирането на хистон е свързано със сърдечна хипертрофия и сърдечна недостатъчност. Въпреки това, патологичните последици от промените в хистоновото метилиране и ефектите от интервенциите с хистонови метилтрансферазни инхибитори върху сърдечната недостатъчност не са напълно изяснени. Ние се фокусирахме върху състоянието на H3K9me3 в сърцето и изследвахме ефектите на хистетиновия инхибитор H3K9 метилтрансфераза хаетоцин върху прогнозата при плъхове, чувствителни към сол на Dahl, животински модел на хронична сърдечна недостатъчност. Хетоцинът удължава преживяемостта и възстановява митохондриалната дисфункция. ChIP-seq анализът показва, че хроничният сърдечен стрес предизвиква увеличаване на H3K9me3 в хиляди повторения, включително интронни области на гени, свързани с митохондриите, като гена, кодиращ активирания от пероксизома пролифератор рецептор гама алфа. В допълнение, хетоцинът обърна този ефект върху тези места за повторение. Тези данни предполагат, че прекомерната хетерохроматинизация на повтарящи се елементи на митохондриални гени в сърцето с увреждане може да доведе до заглушаване на гените и нарушена сърдечна функция. По този начин, хетоцинът може да бъде потенциален терапевтичен агент за хронична сърдечна недостатъчност.

Сърдечната недостатъчност е една от водещите причини за смърт в световен мащаб 1, 2. Въпреки че съществуващите терапии за сърдечна недостатъчност, насочени към ренин-ангиотензин-алдостерон и адренергична нервна система, са ефективни 3, 4, 5, 6, 7, смъртността от сърдечна недостатъчност остава висока 1, 2, 8. Необходими са нови знания за механизмите, лежащи в основата на заболяването, за да се разработи по-ефективна терапевтична стратегия. Митохондриите и метаболитната функция са насочени към лечението на сърдечна недостатъчност, тъй като те са от съществено значение за производството на миокардна енергия, редокс потенциала на клетките, реактивните кислородни форми (ROS), митохондриално зависимата апоптоза, калциевата хомеостаза и метаболизма на мастните киселини и глюкозата.

Патологичната хипертрофия и сърдечна недостатъчност са свързани с променена експресия на много гени 9, 10, 11, 12, 13. Asakura et al. заявява, че много гени за сърдечна недостатъчност участват в пътищата на митохондриалната функция, окислителното фосфорилиране и извънклетъчната сигнализация 14. Епигенетичните промени играят важна роля в регулирането на транскрипционната активност. Модификациите на хистон могат да променят структурата на хроматина, за да повлияят на достъпа на транскрипционен фактор до ДНК и набирането на транскрипционни комплекси до областите на генния промотор/енхансер 15. Известно е, че ацетилирането и деацетилирането на хистон играят роля в развитието на сърдечна хипертрофия и сърдечна недостатъчност 16, 17. В допълнение, инхибирането на активността на хистон деацетилазата (HDAC) предотвратява сърдечното ремоделиране 18. HDAC инхибиторите вероятно имат много механизми на действие 19, включително инхибиране на сърдечната хипертрофия 20, 21, автофага 22, апоптоза 23, сърдечна фиброза 24, 25, възпаление 26, 27 и регулиране на сърдечната контрактилност 28 .

По-рано показахме, че хромозомното разпределение на триметилирането на хистон Н3 лизин 9 (H3K9me3) и триметилирането на хистон Н3 лизин 4 (H3K4me3) се различава от разпределението на ацетилиране на хистон между нормална и сърдечна недостатъчност при животински модели на сърдечна недостатъчност 29. Допълнителни доказателства сочат, че метилирането на хистон в лизин 4 (К4), К9 или К36 хистон Н3 участва в ремоделирането на сърцето 30, 31, 32, 33. Следователно, и хистоновото метилиране, и хистоновото ацетилиране могат да действат като терапевтични цели при лечението на сърдечна недостатъчност.

H3K9me3 е свързан с образуването на хетерохроматин и е необходим за определяне на перицентромерните и теломерните области 34. Промените в нивата на H3K9me3 в различни геномни сайтове, включително сателитни повторения и повтарящи се транспонируеми елементи, също са свързани с отговори на рак и стрес 35, 36. Въпреки това, нито ролята на H3K9me3 при рецидивиращи локуси при сърдечна недостатъчност, нито ефикасността на хистоновите метилтрансферазни инхибитори при сърдечна недостатъчност не са изяснени.

Следователно, в това проучване ние изследвахме състоянието на триметилирането на H3K9 върху повтарящи се елементи в сърцето с увреждане и предположихме, че модифициращият хистон ензим, засягащ състоянието на триметилирането на H3K9, може да играе важна роля при сърдечна недостатъчност. SU (VAR) 3-9 е ензим, който катализира превръщането на K9 в хистон Н3 от диметилираната форма в триметилираната форма. Chaetocin, естествена малка молекула, произведена от гъби от вида Chaetomium 37, е инхибитор на SU (VAR) 3-938. По този начин изследвахме дали този инхибитор на метилтрансферазата H3K9 блокира прогресията на сърдечната недостатъчност при животински модел. В това проучване ние демонстрирахме, че хетоцинът забавя прехода от хипертрофия към сърдечна недостатъчност, възстановява митохондриалната дисфункция при отслабващи сърца и удължава оцеляването на животните.

резултатът

Chaetocin подобри прогнозата при плъхове, чувствителни на Dahl сол (DS) със сърдечна недостатъчност

Въпреки че съдържанието на митохондриална ДНК не се различава между контролната група и HF групата, след лечението с хетоцин се наблюдава значително увеличение на съдържанието на митохондриална ДНК (фиг. 2С). Експресията на гена, кодиращ активирания от пероксизома пролифератор гама рецептор, коактиватор 1 алфа (Pgcla), който играе важна роля в митохондриалната биогенеза и производството на енергия, беше значително увеличена след приложението на хетоцин (фиг. 2D). Тези открития показват, че хетоцинът подобрява митохондриалното дишане, медиирано от повишено съдържание на митохондриална ДНК и експресия на Pgcla в неуспешни сърца.

Сърдечната недостатъчност повишава нивата на H3K9me3 върху повтарящи се елементи и този ефект е обърнат след лечение с хетоцин.

За да изследваме състоянието на H3K9me3 в целия геном, включително повтарящи се елементи в сърцето, извършихме хроматин имунопреципитация (ChIP), за да анализираме последователности, проявяващи H3K9me3 в неуспешна ЛВ със или без лечение с хетоцин и контроли. При 6550 локуса, свързани с повтарящи се елементи, сърдечната недостатъчност причинява увеличаване на H3K9me3 подравняването в сравнение с контролите. Определихме тези елементи като „HF-up“. Деветдесет и девет процента от HF-нагоре локусите, т.е. 6534 повторения, показват съответно намаляване на H3K9me3 в отговор на лечението с хетоцин. За разлика от тях, при 335 локуса, наблюдаваме намаляване на подравняването на H3K9me3 в отслабващото сърце в сравнение с намаляване на контролните групи. Определихме тези елементи като „HF-down“. Прилагането на инхибитор обърна този ефект при 10,4% от тези HF локуси, т.е. 35 повторения (фиг. 3А). По този начин, HF повишава нивата на H3K9me3 върху повтарящи се елементи и chaetocin променя нивата на H3K9me3 в тези локуси, както се очаква, въз основа на инхибиторната активност на H3K9 метилтрансферазата в сърдечните тъкани.

( A ) Брой повтарящи се елементи, за които сърдечната недостатъчност е причинила увеличаване (HF-нагоре) или намаляване (HF-надолу) в H3K9me3 в сравнение с контролите (вляво). Процентно възстановяване на триметилирането на H3K9 след лечение с хетоцин (вдясно). ( Б. ) H3K9me3 нива в интронни повторни региони на Pgcla. Червените квадрати означават област, която е идентифицирана като обогатена за H3K9me3 повтарящи се елементи при плъхове със сърдечна недостатъчност. Черните кутии означават повтарящи се места. Колоните показват подравняване на четенето на повтарящите се елементи H3K9me3. RPM, измерени стойности на милион.

Изображение в пълен размер

Хетоцинът намалява нивата на H3K9me3 при интронни повторения на Pgcla

В това проучване ние се фокусирахме върху геномните региони в непосредствена близост до гените RefSeq. Два повтарящи се локуса в ингтрона на Pgcla показват повишени нива на H3K9me3 в отслабващото сърце и този ефект е потиснат от лечението с хетоцин (Фиг. 3В). Други места за повторение, показващи повишени нива на H3K9me3 в отслабващото сърце, включват няколко геномни области, разположени в непосредствена близост до митохондриални гени. Например, идентифицирахме следните генни региони: Acyl-CoA дехидрогеназен интрон, средна верига, Acadm (Фиг. 4А); две интронни области на Fe-S протеина на NADH-убихинон оксидоредуктаза 4, Ndufs4 (фиг. 4В); и интронната област за хексапренил дихидроксибензоат метилтрансфераза, митохондриален предшественик, Coq3 (Допълнителна фигура 2). В съответствие с епигенетичния профил на H3K9me3, нивата на mRNA на Acadm и Ndufs4 са били реципрочно най-ниски в сърдечно-съдови заболявания, както се определя чрез количествена PCR в реално време. Въпреки че възстановяването на Coq3 иРНК не е било значително при лечението, повишеното ниво на H3K9me3 в сърцето с увреждане в сравнение с контролното сърце може да е допринесло за намаляване на експресията на Coq3. .

Освен това спекулираме, че разликата между пълна промяна в H3K9me3 в отговор на хетоцин в повтарящи се елементи на Pgc1 и по-малко възстановяване на експресията на гена Pgc1a може да се обясни с появата на H3K9me3 и други епигенетични модификации по време на прогресията и развитието на хипертрофия. сърдечен арест. Например, хиастоново деацетилиране и ДНК метилиране могат да се появят в промоторната област. По-нататъшното приложение на HDAC инхибитор може да бъде по-ефективно за възстановяване на експресията на иРНК до базални нива.

Материали и методи

Доставка на животни и лекарства

Всички експерименти с животни в това проучване са одобрени от Институционалния комитет за грижа и използване на животните в Университета на Кейо (09088) и са извършени в съответствие с Институционалните насоки за експерименти с животни в Университета Кейо. Пет седмици мъжки DS плъхове са закупени от Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Токио, Япония). Плъховете бяха разделени на четири групи: контролна [нормална солена диета, съдържаща 0,3% NaCl, NS (-)], нормална сол с хетоцин [0,25 mg/kg хетоцин (Sigma-Aldrich Co. LLC, Сейнт Луис), МО, САЩ ), NS (ch +)], HF [диета с високо съдържание на сол, съдържаща 8% NaCl, HS (-)] и лечение [диета с високо съдържание на сол с 0,25 mg/kg хетоцин, HS (ch +)] групи, Chaetocin се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO). Плъховете в лекуваната група са получавали 0,25 mg/kg хетоцин интраперитонеално два пъти седмично от 6 седмична възраст до 13 седмична възраст, както е описано по-рано 46. Животните се умъртвяват и тъканите се съхраняват подходящо за всеки експеримент.

Кръвно налягане и ехокардиографски изследвания

Нивата на кръвното налягане се измерват след 5, 8, 10 и 13 седмици, използвайки метода на маншета на опашката (BP-98 AL; Softron, Токио, Япония). Сърцата на 13-седмични плъхове бяха оценени чрез ехокардиография с помощта на VisualSonics (Vevo 2100; VisualSonics Inc.). Подробни процедури за измерване на кръвното налягане и ехокардиографска оценка са предоставени в допълнителните методи.

Морфометричен анализ

Сърдечната тъкан беше фиксирана във формалин, вградена в парафин и нарязана на участъци с дебелина 5 μm. Секции бяха оцветени с хематоксилин-еозин или EvG и пикросириус червено, за да се изследва морфологията и да се идентифицира сърдечната фиброза. За да се оцени количеството на колагеновите влакна, се наблюдават срезове с помощта на флуоресцентен микроскоп (BZ-9000; KEYENCE Japan Inc., Осака, Япония). Фиброзната обемна фракция беше оценена като общата фиброзна площ (изчислена от системата за броене на клетки), разделена на общия обем на LV, умножен по 100.

Количествена количествена полимеразна верижна реакция (PCR)

Двуверижната cDNA се синтезира от 2 μg РНК и се подлага на PCR с TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и предварително проектирани генно-специфични праймери и сонди (TaqMan Gene Expression Assays: Applied Biosystems) . Подробни процедури за количествена PCR в реално време са предоставени в допълнителните методи.

ДНК микрочипове

РНК беше извлечена от проби от LV от плъхове със сърдечна недостатъчност, използвайки mirVana (Applied Biosystems), съгласно инструкциите на производителя. Смес от РНК от три проби, произволно избрани във всяка група, беше използвана за анализ на експресията на генома в целия геном, използвайки чип Rat Oligo 20 K (TORAY). Проведен е генно онтологичен анализ с използване на GeneCodis3 (// genecodis.cnb.csic.es/) 47, 48, 49 .

Един грам LV тъкан на група се прилага върху ChIP с 25 μg антитяло (насочено към триметилиран K4 хистон H3 [# 8580; Abcam, Токио, Япония) или триметилиран K9 хистон H3 [# 07-442; Millipore, Temecula, CA, USA]) или 1 μg заешки IgG (# 2729; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Подробни процедури за ChIP са предоставени в допълнителните методи. В тази статия се отчитат само ChIP резултати срещу триметилиран K9 хистон Н3.

последователност

Проби от утаени ДНК фрагменти бяха допълнително фрагментирани преди анализ на последователността (HiSeq 2000). Хроматин имунопреципитираната (ChIP'd) геномна ДНК от всяка група и входната ДНК бяха секвенирани в съответствие с инструкциите на производителя (Illumina). Допълнителни подробности относно подравняването на четенето са предоставени в допълнителните методи.

Промяна на нивото H3K9me3 на повтарящи се елементи

Съпоставихме стойностите на H3K9me3-ChIP’d с геномни свойства чрез съставяне на генома на плъхове rn4 и база данни за повторения на плъхове от UCSC RepeatMasker. Ако съотношението на броя на припокриващите се нуклеотиди между повтарящите се елементи и секвенираните данни към минималния брой нуклеотиди в повтарящите се елементи или при секвенираното отчитане е било 90% или повече, ние го сметнахме за „припокриващо се“. При повтарящи се елементи идентифицирахме обогатени с H3K9me3 региони, които имат 100-кратни разлики в H3K9me3 в сравнение с входната ДНК.

Изолиране на сърдечни митохондрии

Митохондриите са прясно изолирани от 13-седмични сърца, както е описано по-рано 50. Допълнителни подробности са дадени в допълнителните методи.

Потреблението на кислород в митохондриите

Консумацията на митохондриален кислород (дишане на митохондриите) се измерва с електрод Clark O2, използвайки кислород Meter Model 781 и затворена дихателна камера Mitocell MT200 (Strathkelvin Instruments) при 37 ° C, както е описано по-рано 50, 51. Допълнителни подробности са дадени в допълнителните методи.

Съдържание на митохондриални протеини и ДНК

Концентрациите на протеини в митохондриалните фракции бяха измерени с помощта на BCA протеинови анализи. Митохондриалната ДНК, изолирана от сърцето, се анализира чрез количествена PCR в реално време, използвайки Thermal Cycler Dice TP800 в реално време (Takara Bio Inc., Shiga, Япония). Всички проби бяха нормализирани за съдържание на геномна ДНК. Последователностите на праймера и сондата за всяка PCR са изброени в Допълнителна таблица 2.

Статистически анализ

Кумулативните нива на преживяемост на плъхове в различни групи бяха сравнени с помощта на лог-рангови тестове. Всички резултати са представени като средни стойности и стандартни отклонения (SD). Статистическите сравнения бяха извършени с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с корекции след Bonferroni на фигури 1A-D и 4 и post-hoc корекции на Dunnett на фигури 2B-D.

Хранилище за данни

Данните за микрочипове и ChIP-seq се съхраняват в GEO под номера за присъединяване GSE66617 и GSE69194.

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Ono, T. et al. Инхибиторът хистон 3 лизин 9 метилтрансфераза хаетоцин подобрява прогнозата при модел на сърдечна недостатъчност при плъхове, предизвикан от диета с високо съдържание на сол. Sci. Представител. 7, 39752; doi: 10, 1038/srep39752 (2017).

Забележка на издателя: Springer Nature остава неутрален от претенциите за юрисдикция в публикувани карти и институционални асоциации.

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.