произвеждат

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Гладуването предизвиква миграцията на хемопоетични клетки в PVN
  • Характеристики на хематопоетичните клетки в PVN
  • Микроглиите, експресиращи BDNF, са в контакт с PVN невроните
  • Мишките с BM-специфична BDNF делеция са хиперфаги и затлъстяване
  • BMT спасява метаболитни аномалии при дефицит на BDNF
  • дискусия
  • методи
  • Изследвания върху животни и in vivo
  • Имунохистохимия и имуноелектронна микроскопия
  • Микродисекция с лазерно улавяне и изолиране на РНК
  • Количествена RT - PCR
  • ДНК микрочипове
  • Хидролизни сонди в RT - PCR за BDNF варианти
  • Интрацеребровентрикуларно инжектиране на мононуклеарни клетки
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Хематопоетични стволови клетки
  • хипоталамус
  • Невротропни фактори
  • Затлъстяване

абстрактно

Мозъчният невротрофичен фактор (BDNF) потиска приема на храна, като действа върху невроните в хипоталамуса. Тук показваме, че BDNF-продуциращите хематопоетични клетки регулират апетита и енергийния баланс чрез миграция към паравентрикуларното ядро ​​на хипоталамуса. Тези хемопоетични паравентрикуларни ядрени клетки произвеждат микроглиални маркери и осъществяват директни контакти с невроните в отговор на приема на храна. Мишки с вроден дефицит на BDNF, особено хематопоетични клетки, развиват хиперфагия, затлъстяване и инсулинова резистентност. Тези аномалии се облекчават при трансплантация на костен мозък с клетки от костен мозък от див тип. Освен това, когато се инжектират в третата камера, мононуклеарните клетки от костен мозък от див тип остават у дома за паравентрикуларното ядро ​​и обръщат хиперфагията на мишки с дефицит на BDNF. Нашите резултати предполагат нов хранителен контролен механизъм, основан на производството на BDNF в хематопоетичните клетки и сочат към потенциални нови терапевтични лечения за затлъстяване.

Мозъчният невротрофичен фактор (BDNF), член на семейството на невротрофините, се изразява широко в мозъка, включително ключови ядра на хипоталамуса, за които е известно, че са важни за регулиране на енергийния баланс 1, и периферните тъкани, включително мускулите, черния дроб, мастната тъкан и хематопоетичните клетки . 2, 3, 4. В допълнение към ролята си в невротрофното действие, BDNF е централен регулатор на енергийната хомеостаза. Интрацеребровентрикуларната инфузия на BDNF при гризачи намалява храненето и телесното тегло 5, 6. За разлика от това, мишките, които нямат копие на гена Bdnf, развиват хиперфагия и затлъстяване 7, 8. При хората генетичната хаплоинфекциозност на BDNF 9, мутациите в гена, кодиращ неговия TrkB рецептор (NTRK2) 10, и проучванията за асоцииране 11, 12 заедно включват BDNF в регулирането на приема на храна и развитието на затлъстяване.

За да се идентифицира произходът на производството на BDNF за регулиране на енергийния баланс, предишни проучвания са се фокусирали върху цели мозъчни неврони или върху специфични ядра в хипоталамуса 13. С оглед на последните открития, че хематопоетичните клетки са дом на мозъчните тъкани и че хематопоетичните клетки експресират богат BDNF 2, 3, 4, ние изследвахме дали BDNF, произведен от хематопоетични клетки, които са дом на мозъчните тъкани, участва в регулирането на енергийния баланс и апетита .

резултатът

Гладуването предизвиква миграцията на хемопоетични клетки в PVN

Осем седмични мишки C57BL/6 получиха облъчване на цялото тяло (9 Gy) и трансплантация на костен мозък (BMT) (BMT) от мишки C57BL/6, трансфектирани със зелен флуоресцентен протеин (GFP) 14. Осем седмици по-късно преброихме броя на клетките, получени от GFP, в различни ядра на хипоталамуса при различни условия на хранене (фиг. La-c). Открихме, че получените от BM хематопоетични клетки са свързани с хипоталамуса, по-специално в паравентрикуларното ядро ​​(PVN), центърът за насищане за ядене и пиене. Интересното е, че гладуването (16 или 24 часа) доведе до значително увеличен брой GFP + клетки в PVN (фиг. 1б); броят се връща към изходното ниво в рамките на 4 часа след многократно приложение след 16-часово гладуване (Фиг. 1в). GFP + клетъчната плътност не се е променила значително в други изследвани хипоталамусни ядра (фиг. 1г).

40% от GFP + клетки произвеждат трансформиращ растежен фактор-β (допълнителна фигура S1b), получен от микроглия фактор, който насърчава оцеляването на невроните 17 .

Характеристики на хематопоетичните клетки в PVN

Мишките с BM-специфична BDNF делеция са хиперфаги и затлъстяване

а ) Схема на стратегия за генериране на вродено изтриване на специфични за BMDC BDNF (BM-BDNF -/-) чрез кръстосване на Bdnf tm3Jae/J и B6.129P2-Lyzs tm1 (cre) Ifo/J генотипове. Праймери 1 и 2 са предназначени за откриване на геномна ДНК. Праймери 3 и 4 са предназначени за откриване на иРНК. ( б ) Имунооцветяване за BDNF и Iba1 в PVN BM-BDNF -/- и контролиране на LysM-cre мишки (BM-BDNF +/+). Стрелката показва колокализация на оцветяване за BDNF и Iba1 в BM-BDNF +/+ клетки, а стрелката показва липсата на такава колокализация в BM-BDNF -/- клетки. Скала, 10 μm. ( ° С ) Анализ за съвместна локализация на BDNF оцветяване и експресия на GFP в GFP-TG/BM-BDNF -/- клетки. GFP-TG/BM-BDNF -/- мишки са създадени чрез кръстосване на мишки GFP-TG и BM-BDNF -/-. BDNF не е локализиран съвместно с GFP в GFP-TG/BM-BDNF -/- клетки. Скала, 10 μm. д ) Геномен анализ на BM-BDNF -/-. Генът от 1,3 kb BDNF се изтрива в мононуклеарни клетки и GFP-положителни клетки, получени от PVN мишки GFP-TG/BM-BDNF -/- от LCM. ( д ) Експресия на BDNF иРНК. BDNF иРНК не се експресира в GFP-положителни клетки, получени от PVN мишки GFP-TG/BM-BDNF -/- от LCM.

Изображение в пълен размер

( а - ° С ) Сравнение на телесното тегло ( а ), прием на храна б ) и прием на вода ( ° С ) в BM-BDNF -/- и контролирайте Cre (BM-BDNF +/+) мишки (n = 10). Горна: мъжка, долна: женска. д ) Сравнение на нивата на глюкоза и инсулин и съответната AUC при интраперитонеална GTT при BM-BDNF -/и контролни мишки Cre (n = 8-11). GTT, тест за глюкозен толеранс; AUC, площ под кривата. д ) Консумация на O 2 на BM-BDNF -/- в сравнение с контролните мишки на Cre в светли и тъмни периоди (n = 12). Всички данни представляват средни стойности ± sd * P

( а - в ) Телесно тегло ( а ), прием на храна б ) и прием на вода ( ° С ) при BM-BDNF -/- мишки, получаващи BMT от BM-BDNF +/+ или BM-BDNF -/- мишки (n = 10)). Горни графики: мъжки, долни: женски. д ) Нива на глюкоза и инсулин и съответната площ под кривата (AUC) 5 месеца след BMT в същите групи като в (n = 5-6) в GTT. д ) консумация 2 6 месеца след BMT в същите експериментални групи като в а (п = 9). Промени в приема на храна ( е ) и вода ( ж ) след интрацеребровентрикуларна инжекция на мононуклеарни клетки (n = 4-6). Данни: средно 7 дни след инжектиране на клетки. ( з ) Микроскопски анализ на инжектирани GFP-положителни клетки в PVN. Ляв панел: BM-MNCs, изолирани от GFP-Tg/BDNF +/+ мишки, бяха инжектирани в третата камера (3V) на BM-BDNF -/- мишки. Десен панел: Инжектирани са BM-MNC, изолирани от GFP-Tg/BDNF -/- мишки. Стрелка: GFP-положителни клетки. Скала, 50 μm. Всички данни представляват средни стойности ± sd * P + P = 0,06, + P = 0,08.

Изображение в пълен размер

Тъй като моноцити и макрофаги присъстват в множество органи 27, делецията на гена BDNF в отговор на активността на Cre, задвижвана от промотора на LysM, не е необходимо да се ограничава до мозъчни микроглиални клетки. Поради това сравнихме ефектите от инжектиране на физиологичен разтвор или BM-MNC, изолирани от GFP-TG/BDNF +/+ или GFP-TG/BM-BDNF -/- мишки в третата камера на BM-BDNF -/- мишки. По време на относително кратък период от 8 дни след интрацереброваскуларно инжектиране, през който се наблюдава значително намаляване на приема на храна (фиг. 5е) и приема на вода (фиг. 5ж) при BMT реципиенти на GFP-TG/BDNF +/+ хематопоетични клетки, получени от донори GFP + BM клетки бяха откриваеми при мишки получатели на PVN (Фиг. 5h).

дискусия

Няколко линии доказателства, представени в това проучване, предполагат, че BDNF, получен от хематопоетични клетки, изглежда е толкова важен, колкото BDNF, получен от неврони, за контролиране на апетита и затлъстяването при възрастни животни. В отговор на 16-часовите бързи хемопоетични клетки, които са дом на PVN, където те придобиват много характеристики на микроглията и влизат в контакт с местните неврони. Като произвеждат хемопоетично специфичен вариант на BDNF, тези получени от BM клетки регулират приема на храна чрез PVN.

Важно е да се отбележи, че индуцираното на гладно индуциране на клетки, получени от BM, до PVN, се наблюдава при облъчени от цялото тяло мишки при отсъствие или наличие на щит за глава. Облъчването на ЦНС само по себе си може да увреди съдовата система в мозъка и да позволи необичайно навлизане на микроглиални предшественици от циркулацията в ЦНС 15, 16. Ние обаче показахме, че при нашите експериментални условия е имало само леко и незначително увеличение (

17%) от броя на получените от BM клетки, които мигрират към PVN при безглави мишки в сравнение с челните щитови клетки. Освен това, 16-часово бързо предизвикване на сравнително увеличение на броя на хематопоетичните клетки, индуциращи PVN при мишки, защитени от главата, в сравнение с незащитени облъчени мишки.

Естеството на сигнала, който стимулира миграцията на хематопоетичните клетки към PVN, изисква допълнителни изследвания. Интересното е, че анализът на микрочиповете разкрива, че иРНК за Cxcl2, хемокин, произведен от ендотелни и нервни клетки, е> 30 пъти по-висок при PVN на гладно в сравнение с хранени мишки (Допълнителна таблица S2). Хемокините и цитокините участват в въвеждането на получена от BM микроглия или клетки в нервната система, особено в отговор на нараняване или исхемия в мозъка 17 или увреждане на гръбначния мозък 29. Cxcl2 показва силна хемотаксична активност срещу търговия с BM/хематопоетични клетки. Повишената му експресия в PVN при тези животни може да предизвика миграция на клетки, получени от BM, до PVN за 16 часа бързо.

Това е първоначалният доклад за гладуване на хемопоетични клетки, предизвикано от глад на PVN, хипоталамусното ядро, където BDNF, произведен от тези клетки, може да регулира отрицателно апетита. In vivo ефикасността на BDNF, получен от BM, е очевидна при BM-BDNF -/- мишки, чиято неспособност да реагират на свръхпроизводство на BDNF на гладно в техния PVN се проявява под формата на полидипсия, хиперфагия и затлъстяване. Други лаборатории съобщават, че предизвиква глад

50% намаляване на нивата на BDNF-mRNA при VMH 5, 30, 31 мишки, реакция, която се очаква да доведе до увеличаване на апетита. Важното е, че след 16-часово гладуване не открихме промяна в BDNF във VMH. В съответствие с това наблюдение, други са установили, че BDNF транскриптите не намаляват в VMH до 48 часа бързо. Контролът на апетита включва всеобхватна мрежа от регулаторни възли, които покриват различните органи на стомашно-чревния тракт в различни области на мозъка 32. Сравнително острото набиране на BDNF-продуциращи хемопоетични клетки в PVN може да бъде хомеостатичен отговор на стрес на гладно. Въпреки че е вероятно ранното повишаване на BDNF в PVN (чрез свързване на хематопоетични клетки) да проправи пътя за забавено регулиране на BDNF в VMH, точната връзка между двата процеса изисква допълнителни изследвания. В това проучване основно изследвахме CRH невроните. Въпреки това, при PVN, други неврохормони, като освобождаващ тиреотропин хормон, окситоцин и несфатин, могат да участват в контрола на храненето и метаболизма и заслужават допълнителни изследвания в бъдеще.

Съществената роля на хематопоетичната експресия на BDNF в контрола на апетита е силно подкрепена от редица експерименти, включващи мишки, загубили способността да произвеждат BDNF (и мишки, възстановяващи този капацитет) изключително в клетки, получени от BM. Наскоро е установено, че хемопоетични клетки, получени от BM, мигрират към хипокампуса след стрес, предизвикан от шокове на крака при мишки 14. По този начин е показано, че различни видове стимули мигрират клетки, получени от BM, в определени региони на ЦНС. От десетилетия е известно, че хемопоетичните мононуклеарни клетки произвеждат BDNF, въпреки че възможната функция на периферните клетки, произвеждащи такава мощна биоактивна молекула, е неуловима. Сега, когато признаваме, че хематопоетичните клетки имат достъп до специфични региони на ЦНС в отговор на различни стимули, се надяваме, че представените тук констатации ще насърчат откриването на други функции на ЦНС, които потенциално се регулират от генни продукти, произведени от хемопоетични клетки. И накрая, откритието за участието на лесно достъпни хемопоетични клетки в контрола на апетита е предоставило нова перспектива за патогенезата, като същевременно може да ускори разработването на нови терапии за затлъстяване, както и синдроми за нарушаване на апетита като анорексия нервна. и булимия.

методи

Проучвания върху животни и in vivo

Имунохистохимия и имуноелектронна микроскопия

Микродисекция с лазерно улавяне и изолиране на РНК

Проби от тъкани от замразени участъци с дебелина 12 μm за анализ на РНК са получени от всяко хипоталамусно ядро ​​или 50 уловени GFP-положителни или отрицателни клетки върху единична капачка CapSure HS LCM (Arcturus Engineering, Mountain View, CA), като се използват следните параметри: размер на петно ​​= 7,5 μm; мощност = 50–80 mW; и продължителност на импулса = 50–1000 μs. Общите РНК бяха изолирани с PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturs) и третирани с DNase I (Invitrogen).

Количествена RT - PCR

Извършихме количествена RT - PCR с LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit и LightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics). Излъчената флуоресценция за всяка реакция се измерва три пъти по време на фазата на отгряване/удължаване и графиките за усилване се анализират с помощта на LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Потенциалното замърсяване на геномната ДНК се контролира чрез използването на някои обхващащи интрон праймери и разлагане на DNase. Относителната стойност във всяка проба беше изчислена чрез стандартната крива, получена от контролни проби и стандартизирана като коефициент, разделен на стойността, едновременно получена за глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) в същия експеримент. CDNA с първа верига се използва при последващи PCR анализи. Използвани са следните праймери: BDNF; 5 ′ праймер нагоре по течението, 5′-TTGTTTTGTGCCGTTTACCA-3 ′ и 3 ′ грунд надолу по веригата, 5′-GGTAAGAGAGCCAGCCACTG-3 ′, GAPDH; 5 ′ праймер нагоре по веригата, 5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3 ′ и 3 ′ грунд надолу по веригата, 5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3 ′. Идентичността на PCR продуктите се потвърждава от размера след електрофореза в агарозен гел и анализ на нуклеотидна последователност. Сигналът, произтичащ от GAPDH иРНК, служи като вътрешен контрол за оценка на разликите между различните проби.

ДНК микрочипове

Уловихме GFP-положителни клетки от пет различни мишки GFP-BMT или цели PVN от пет мишки от див тип, както в хранене, така и на гладно (16 часа) от LCM. Пробите бяха изпратени до Bio Matrix Research Laboratory (Япония), където пробите от РНК бяха проверени от Agilent 2100 BioAnalyser (Agilent Technologies) и NanoDrop (NanoDrop Technologies). Пробите от РНК се амплифицират чрез двуциклово целево маркиране, превръщат се в биотинилирана кДНК и се хибридизират в масива Affymetrix Mouse Genome U34A GeneChip (Santa Clara, CA). Използвахме Gene Spring Viewer (Agilent Technologies), за да анализираме данните и изчислихме съотношението на изразяване (r = на гладно/хранене). Показахме експресията на гени, свързани с микроглията (LCM на GFP-положителни клетки), и цитокини и гени, свързани с възпалението (LCM на цели PVN) с резултат r> 2 и r 21 (допълнителна таблица S4). Амплификацията се извършва с PCR тестове в реално време, като се използват 5′FAM сонди (Sigma Genosys) на LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Крайният реакционен обем от 20 μl включва 5 μl cDNA, 0,5 μM от всеки праймер (преден праймер и обратен праймер), 0,1 μM от 5′FAM сонда и 10 μl LightCycler 480 Probes Master (Roche Diagnostics).

Интрацеребровентрикуларно инжектиране на мононуклеарни клетки

Изолирахме мононуклеарната клетъчна фракция от BM на мишка, използвайки Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). След обезболяване, главата на мишките беше закрепена с помощта на стереотаксични инструменти (SR-6, Scientific Instrument Lab., Токио, Япония). Клетките се инжектират в третата камера с помощта на 30-G игла, прикрепена към спринцовка Хамилтън, съгласно координатите, получени от учебника от Paxinos и Watson 34 (-0,82 mm от брегмата). Инжектираният обем на клетъчната суспензия е 5 μl и броят на клетките на мишка е 1 × 106 .

Статистически анализ

Резултатите са представени като средни стойности ± sd Статистическият анализ е извършен с помощта на софтуера SPSS Statistics 19. T-тестът на Student е използван за сравняване на две независими групи, а еднопосочният дисперсионен анализ или повторен дисперсионен анализ, последван от теста за многократно сравнение, е използван за сравнение на три или повече групи. Статистически значима разлика беше определена като P-стойност