Генетично значими отклонения при пациенти с миелодиспластичен синдром и методи за тяхното откриване

Резюме:

Миелодиспластичният синдром (MDS) е хетерогенна група клонални хемопоетични заболявания на костния мозък. Заболяването се определя от неефективна хемопоеза, диспластични промени в кръвните клетки и наличие на цитопения в периферната кръв. Пациентите обикновено са по-възрастни и приблизително 30% от всички пациенти по-късно се трансформират в остра миелоидна левкемия (ОМЛ). Клонални хромозомни аномалии се откриват при приблизително 50% от пациентите с първична MDS и при повече от 80% от пациентите с вторична MDS. Въз основа на специфични хромозомни аномалии може да се предскаже прогнозата на пациента, общата преживяемост и подходящо лечение. Използвахме цитогенетичен анализ на кариотипа, флуоресценция in situ хибридизация (FISH) и мултиплекс лигиране, зависима амплификация на сондата (MLPA), за да изследваме пациентите и да докажем тези аномалии.

отклонения

Ключови думи: миелодиспластичен синдром, хромозомни аберации, диагностика

* Всички таблици, графики и фигури, които са част от статията, могат да бъдат намерени в прикачения PDF файл в края на изследването.

Причини за MDS

Разработването на MDS е многоетапен процес, при който настъпват промени в генетичния материал на плурипотентна хематопоетична стволова клетка. Той е морфологично и функционално различен и придобива предимство за растеж. Понастоящем механизмът на патогенезата на MDS не е напълно изяснен, смята се, че участва гените, регулиращи растежа, диференциацията и клетъчната смърт. Променената клетка се размножава и постепенно клонингите заместват здравите стволови клетки, като по този начин отслабват или спират нормалната хемопоеза (4). Различаваме два вида MDS - първичен и вторичен. Говорим за първичното, когато причината за заболяването е неизвестна. Той представлява 85% от всички MDS и засяга главно възрастното население със средна възраст 60-70 години. Честотата на първичните MDS се увеличава през последните години поради по-добрите диагностични методи, застаряването на населението и факторите на околната среда (5). За вторични MDS (

15%) можем да изясним причините за заболяването. Може да има няколко, като химиотерапия, лъчетерапия или въздействието на токсините от околната среда (6).

Прогноза на заболяването

Ходът на заболяването е много променлив, от най-леките форми със средна преживяемост от няколко години до най-тежките форми с преживяемост по-малка от 5 месеца (7). По отношение на прогнозата има няколко прогностични системи, които класифицират пациентите в рискови категории въз основа на свързани характеристики (8). В момента се използва Преработен Международна система за прогностично оценяване - IPSS-R, което разделя пациентите на 5 рискови категории в съответствие със специфични параметри, показващи прогностична значимост и според които се извършва лечение. IPSS-R включва i MDS Cyтогенетична система за точкуване (Таблица 1), което определя прогностичната група на пациента въз основа на цитогенетични находки в кариотипа (9).

Хромозомни аберации

Хромозомните аберации играят важна роля в патогенезата, прогнозата и диагностиката на заболяването. При първична MDS те са докладвани при 40-60% от пациентите. Пациентите с вторичен MDS обикновено имат повече промени в генотипа, като хромозомните пренареждания се наблюдават при до 80-90% (6). Комплексен кариотип с повече от три отклонения наведнъж се наблюдава при приблизително 15% от de novo MDS срещу 50% при вторични MDS (10).

Най-честите промени включват del (5q)/- 5, 01507/del (7q), +8, del (20q) а –Y. Нечести, –17/del (17p)/i (17q), –18/del (18q), +21, +19, inv/t/del (3q), –13/del (13q), –21, t (5q), +11, + 1/+ 1q, del (12p), del (11q), t (7q), + mar и други (7.11).

Според настоящите промени в клетките можем да предположим прогноза на заболяването. При пациенти с добра прогноза откриваме нормален кариотип или само прости промени. Ходът на заболяването е лек, дълготраен с преживяемост от няколко години и лечението е предимно симптоматично. Колкото по-лоша е прогнозата, толкова по-кратко е времето за оцеляване на пациентите, различните генетични промени са налице и толкова по-голяма е вероятността от левкемична трансформация (12).

Методи за откриване на генетични промени

1. Цитогенетичен анализ

Цитогенетичният анализ на хромозомите е един от основните методи за откриване на аберации. Позволява да се наблюдават числени и структурирани реконструкции на кариотипа. Голямото предимство на метода е възможността да се изследват всички хромозоми в един изглед. Недостатъкът е невъзможността да се идентифицират субмикроскопски промени под границата на откриване на метода и в същото време необходимостта от метафази.

2. FISH метод

Флуоресценцията in situ хибридизация (FISH) е често срещан метод в цитогенетичните лаборатории и нейните предимства включват възможността за анализ на клетките не само в метафаза, но и в интерфаза, когато клетъчната култура не е необходима. Друго предимство е бързият анализ на голям брой клетки. В същото време това дава възможност за откриване на аберации в около 15% от цитогенетично отрицателните случаи и помага за изясняване на сложни реконструкции. Ограничаващ фактор на метода е възможността да се идентифицират само онези участъци от ДНК, в които се използват сонди. За подходящо откриване, в пробата трябва да присъстват поне 1-5% от анормалните междуфазни ядра.

маса 1. MDS цитогенетична система за точкуване (9, модифицирана)

3. MLPA анализ

Подобно на FISH, методът на мултиплексно лигиране-зависима амплификация на сонда (MLPA) използва свързването на олигонуклеотидни сонди към прицелна ДНК последователност въз основа на тяхната комплементарност. За разлика от FISH, този метод е в състояние да идентифицира повече от 40 различни ДНК последователности в една реакция (13). Сондите, използвани в метода MLPA, имат по-малка дължина (50 - 70 bp) и позволяват чувствително откриване на други клинично значими аномалии на MDS с по-ниска честота. Предимството на MLPA е диференцирането на последователности, които се различават една от друга с една нуклеотидна разлика. Недостатък на техниката е необходимостта да има поне 30% от мутиралите клетки в пробата за надеждно откриване на аномалии (14).

Целта на нашата работа беше:

  1. Създайте и анализирайте набор от пациенти с диагноза MDS, изследвани в нашия генетичен отдел в периода от февруари 2016 до април
  2. Определете наличието на хромозомни аберации, характеризирайте ги, определете честотата им в групата и разделете пациентите според настоящите аберации.
  3. Оценете връзката между резултатите от теста и прогнозата.
  4. Да се ​​определи приноса на отделните методи за оценка на хромозомните аберации и да се сравни успехът на използваните методи - класическа цитогенетика, FISH метод и метод

Популация от пациенти и методи

Записахме пациенти с диагноза MDS, които бяха изследвани в нашата генетична лаборатория от февруари 2016 г. до април 2018 г. Критерият за записване на пациента беше диагнозата, поставена от лекар при поискване. Анализирахме общо 620 проби от пациенти, от които 383 проби от костен мозък (KD) и 237 проби от периферна кръв (ПК). В тази работа използвахме следните методи: цитогенетика, FISH и MLPA.

Препаратите за анализ на кариотипа се приготвят чрез култивиране на KD клетки в пълна среда за 24 часа и се обработват съгласно стандартните процедури. При 360 пациенти са анализирани 20 метафази, ако е възможно, и е определена цитогенетична нотация съгласно ISCN (Международната система на хромозомната номенклатура). В метода FISH, култивиран KD и/или PK на пациент, приготвен чрез директна обработка, се използва като изходен материал. Впоследствие се извърши хибридизация с подходяща сонда и оценка на препаратите под флуоресцентна микроскопия. Бяха оценени общо 521 проби, 380 KD и 141 PK. Входният материал за MLPA анализ беше изолирана ДНК от KD и/или PK проба, доставена в EDTA. Комплектът SALSA MLPA P414-B1 MDS probemix (MRC - Holland) е използван за анализи за откриване на 46 специфични хромозомни области с амплификационни продукти от 122 до 469 нуклеотида. Сондите са предназначени за най-често срещаните и прогностично значими отклонения в MDS съгласно IPSS-R. Този метод изследва 398 пациенти (214 KD и 184 PK).

Резултатите

1. Характеризиране и анализ на група пациенти

Комплектът включва проби от костен мозък или периферна кръв от 620 пациенти и се състои от 289 (46,6%) пациенти от мъжки пол и 331 (53,4%) от жени. Средната възраст на пациентите към момента на поставяне на диагнозата е 69 години с възрастов диапазон от 13 до 93 години. Пациентите, изследвани от проба от костен мозък, са имали патологии в 36% от случаите, пациентите, изследвани от проба от периферна кръв, само в 14% от случаите.

1. Честота на хромозомни аномалии

От резултатите от проби от костен мозък на 383 пациенти, които бяха изследвани цитогенетично, от FISH и/или MLPA, характеризирахме и впоследствие определихме появата на най-честите аномалии. Открихме общо 287 хромозомни аберации, като най-малко два метода бяха използвани за изследване при 99% от пациентите. Графиката показва индивидуалното представяне на аберациите като изолирани аномалии в генома и като аномалии, възникнали в комбинация с други патологии.

2. Определяне на прогнозата на пациентите

Прогнозата и средната преживяемост на 383 пациенти бяха определени с помощта на тестови резултати от анализи на проби от костен мозък, получени чрез цитогенетика, FISH и/или MLPA. Бяха оценени представителността на отделни пациенти в прогностичните групи и тяхната обща преживяемост.

Изчислихме средната преживяемост чрез статистическия метод на Kaplan-Meier заедно за 351 пациенти, от които имахме налична информация за преживяемост, респ. смърт. Успешно определихме медианата в групите: средна, лоша и много лоша. В много добрите и добри групи пациентите са имали по-висока преживяемост и при тяхната прогноза вероятността за оцеляване не е падала под 0,5 (50%). Следователно не получихме съответни данни, тъй като голяма част от пациентите все още са живи. Графиката показва, че при по-лоша прогноза оцеляването на пациентите също намалява. IN в таблица 3 е обобщение на данни от отделни рискови групи. Показани са броят на пациентите в групите, броят на смъртните случаи и тези, живеещи в групата, и процентът на оцеляване на групата.

3. Определяне на успеха на използваните методи

80 пациенти са изследвани едновременно и по трите метода. Този файл е използван за сравнение на успеха на използваните методи. Сравнихме броя на успешните анализи на отделни методи, които потвърдиха поне един хроанализ. Той се оказа най-чувствителният метод за откриване на наличието на аберации. Анализът на кариотипа е положителен в 60 (75%) случая. Скрининговият метод MLPA показа сравним успех с цитогенетичния анализ. Тя регистрира положителна находка при 59 (74%) пациенти.

Дискусия

MDS е заболяване на предимно възрастни хора със средна стойност 70 години към момента на поставяне на диагнозата, групата под 50 години се състои от

10% от пациентите (2). В нашето проучване средната възраст е 69 години, а броят на пациентите под 50 години е 15%. Честотата на MDS нараства бързо с възрастта над 60 години. Greenberg et al (9) съобщават, че до 77% от пациентите са на възраст над 60 години по време на диагностицирането. В нашата работа пациентите на възраст над 60 години представляват 74%.

За стандартни анализи са използвани 383 проби от костен мозък и 237 проби от периферна кръв. Пациентите, изследвани от проба от костен мозък, са имали патологии в 138 (36%) случая, пациенти, изследвани от проба от периферна кръв, само в 34 (14%) случая. В литературата се съобщава, че откриването на патологии в костния мозък на пациентите варира от 37 до 55% (9,11,12). Останалите пациенти са имали отрицателна находка. Не са налични проучвания за откриване на аномалии в цялата периферна кръв. Въз основа на нашите резултати можем да заявим, че костният мозък е по-подходящ биологичен материал за анализ от периферната кръв. Тук възниква самата болест, има по-голяма честота на патологични клетки и по този начин по-високо откриване на аберации.

Причината, поради която получихме по-ниски средни стойности на оцеляване и не постигнахме резултати за групи с много добра и добра прогноза, може да е кратък период на проследяване. Нашите резултати потвърдиха, че общата преживяемост на пациентите се съкращава, тъй като прогнозата се влошава.

Също така сравнихме успеха на използваните диагностични методи. Оценихме група пациенти, които бяха изследвани по трите метода наведнъж. Пациентите не биха могли да имат отрицателна находка и методите трябваше да открият поне една аномалия. Доказано е, че методът FISH е най-чувствителен за откриване на наличието на патологии. Тя успешно открива патология в 85% от случаите. FISH има висока чувствителност и специфичност за целевия регион в ДНК. Той открива аномалии с разделителна способност от 100 kb до 1 Mb, но улавя само областта на хромозомата, в която се използва сондата. Анализът на кариотипа (75%) и методът MLPA (74%) показват сравним успех. Анализът на кариотипа улавя числени и структурни аберации на всички хромозоми наведнъж до граница на откриване от около 5 Mb и е ограничен от неуспешно култивиране на клетки в средата (20).

В същото време методът MLPA позволява скрининг на 46 специфични области, които също включват по-рядко срещани аномалии на MDS. Ограничението му обаче е, че не може да улови балансирани генетични пренареждания и се нуждае от поне 25-30% от засегнатите клетки в пробата (21).

Заключение

Понастоящем заболеваемостта от MDS нараства в Европа и се очаква да нараства с 25 000 нови случая всяка година. Причината е не само застаряването на населението, но и увеличаването на замърсяването на околната среда. Ето защо точната диагноза на пациентите, правилното определяне на прогнозата и последващото определяне на подходяща терапия са много важни. Днес при диагностицирането на аберации се използват стандартни генетични методи, като цитогенетично изследване на кариотипа, FISH метод и MLPA анализ, всеки от които има свое уникално място и тяхната взаимна комбинация гарантира улавянето на колкото се може повече аберации в генома на пациент с MDS.