елементи

абстрактно

Целта на това проучване беше да се изследва полезността на секвенирането на ново поколение (NGS) на голям брой гени, свързани със сърдечни каналопатии и кардиомиопатии в група от 61 жертви на SUD в съдебна среда в Дания.

внезапни

Материали и методи

Проучване на популацията

Между 2009 и 2011 г. 348 млади (1-50 години) починали лица, за които се предполага, че са починали от естествена смърт, са били аутопсирани в раздела за съдебна патология, Катедра по съдебна медицина, Здравен и медицински факултет, Университет в Копенхаген От тях 142 лица са класифицирани като SCD, включително случаи с отрицателна аутопсия. Общо 61 индивида починаха внезапно, неочаквано и без патогенни находки след задълбочено макро- и хистопатологично изследване. Токсикологичният скрининг не разкрива лекарство на токсично ниво, което би могло да обясни смъртта във всеки от тези случаи. Останалите 81 случая са разследвани в предишни проучвания за други сърдечни причини за смърт. Двадесет субекта бяха класифицирани като кардиомиопатия (дяснокамерна аритмогенна кардиомиопатия (ARVC) = 14, хипертрофична кардиомиопатия (HCM) = 6), 52 субекта, които имаха недиагностични структурни сърдечни аномалии при 15 и 9 субекта като внезапна неочаквана детска смърт. 16.

Генетично тестване

Досега описахме методи за генетични изследвания в Hertz et al. Накратко, ДНК беше извлечена от цялата кръв на 57 индивида с помощта на QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Stockach, Германия). ДНК беше извлечена от прясно замразени мускули от един субект и от прясно замразена тъкан на далака от трима субекта с помощта на EZ1 DNA Investigator Kit (Qiagen). Извлечената ДНК се определя количествено с Quantifiler Human DNA Quantification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) съгласно протокола на производителя. ДНК от двете проби се амплифицира с целия геном, като се използва REPLI-g Midi комплект (Qiagen) съгласно протокола на производителя поради ниската концентрация на ДНК.

NGS е използван за изследване на 100 гена, за които преди е установено, че са свързани с наследствени сърдечни заболявания и SCD (Таблица 1). Гените бяха избрани от наличната литература в PubMed и Online Mendelian Inheritance in Man (//omim.org/).

Маса в пълен размер

SureDesign (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ) беше използван за проектиране на сонди за улавяне на целеви региони на екзон и UTR от 100 гена за системата за обогатяване на целевата система Haloplex със 150 bp (Agilent Technologies). Дизайнът включваше всички кодиращи екзони, 25 bp съседни интрони и 5'- и 3'-UTR региони от 100 желани гена до общо 2076 области с общ размер 787,943 bp. Като цяло 99,6% от целта е била покрита> 50 ×. Два екзона не бяха достатъчно покрити от секвениране, а седем екзона не бяха секвенирани поради липсващ дизайн на сондата. Подробности за геномните региони, които не са достатъчно покрити, могат да бъдат намерени в Допълнителна таблица S1. Средното покритие на ампликоните е 950 (диапазон: 206 - 3065).

Протоколът за обогатяване на цели Haloplex, версия D.5, беше използван в съответствие с инструкциите на производителя. Протоколът включва следните стъпки: (1) усвояване на 200 ng геномна ДНК с различни рестрикционни ензими в осем епруветки и анализ на фрагменти с помощта на 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies); (2) хибридизация на усвоената ДНК до сонди Haloplex с краища на сонда, които допълват целевите фрагменти. По време на хибридизацията фрагменти бяха циркулирани и бяха включени индекси, мотиви на последователността и биотин; (3) целевата ДНК е уловена с магнитни топчета Haloplex; (4) никове в циркулирани фрагменти бяха затворени чрез лигиране; и (5) елуиране с NaOH, PCR амплификация, пречистване и окончателно елуиране с Tris-HCl буфер на уловената прицелна ДНК. След сглобяването на библиотеката количеството ДНК се измерва с помощта на Qubit Fluorometer 2.0 с dsDNA HS анализ (Invitrogen, Life Technologies Europe BV, Nærum, Дания). Разпределението на размера на ДНК се анализира с помощта на 2100 биоанализатор и ДНК комплект с висока чувствителност (Agilent Technologies). Всички проби бяха секвенирани на MiSeq (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ), съгласно препоръките на производителя със сдвоено крайно секвениране от 150 bp, като се използва MiSeq Reagent Kit V2 (300 цикъла).

Анализ на данни и биоинформатика

Досега описахме подробно анализа на данните в Hertz et al. Накратко, файловете fastq, създадени от MiSeq, бяха използвани за по-нататъшно подравняване и анализ. SureCall (Agilent Technologies) беше използван за анализ на базови разговори, използвайки стандартни настройки и техния стандартен алгоритъм. Пълен списък на идентифицираните варианти е даден във Формат на обаждащия се вариант.

Alamut Batch v.1.2.0 и Alamut Visual v.2.5 (Interactive Biosoftware, Rouen, France) бяха използвани за анотиране и оценка на варианти, както е описано в Hertz et al. Вариантите бяха оценени чрез (1) in vitro аналитичен инструмент in vitro, разработен за определяне на вероятността от патогенност на варианта и (2) честоти от 17

Вариантът е класифициран като с неизвестно значение, в случай на честота над разпространението на заболяването според наличната литература, неконсервирана аминокиселинна субституция, множество наблюдения на варианта в кохортата или липса на значителна връзка с някакви сърдечни заболявания и нуклеотиди в регионите вариантът е намерен.

Гените и ДНК вариантите са номерирани според референтните последователности, използвани в Таблица 1, като се използва HGVS номенклатурата (www.HGVS.org). Вариантите бяха изпратени в базата данни за отворени вариации в Лайден (//databases.lovd.nl/shared/individuals, Индивидуален идентификатор: 00064702–00064741).

Покритието се изчислява с помощта на python скрипт, който изчислява покритието за всеки ампликон, използвайки Bedtools покритиеBed. Amplicons, където всички проби имаха 23, бяха използвани за извършване на статистически анализи и оценка на варианти в in silico анализ с помощта на персонализиран скрипт.

Етични стандарти

Изследването е одобрено от Комитетите по етика на здравните изследвания в Дания (H-2-2012-017) и Датската агенция за защита на данните (2011-54-1262).

резултатът

Проучване на популацията

Включихме 61 лица, които след щателен медицински преглед починаха внезапно и неочаквано без патогенни находки и бяха класифицирани като SUD. Средната възраст при смърт е 39 години (диапазон 1-50) и 43 (70%) мъже (Таблица 2). Посмъртните токсикологични изследвания са извършени в 54 (89%) случая, от които 16 (30%) са отрицателни. Не е открито лекарство в токсична концентрация, което да обясни смъртта в нито един от тези случаи.

Маса в пълен размер

Двама мъртви индивида (3%) са имали фамилна анамнеза за сърдечни заболявания. Бащата на едно лице е починал на 56-годишна възраст от неуточнена сърдечна причина. При този индивид не е открит вариант с вероятен функционален ефект. Двама близки роднини на другия индивид са починали по време на сън в млада възраст без известна причина. При този индивид са открити два варианта с вероятни функционални ефекти (Таблица 3, ID 7).

Маса в пълен размер

В нашето проучване 16 (26%) случая на SUD са имали психиатрични заболявания според наличните медицински досиета. Седем (13%) и осем (15%) са използвали антипсихотици, съответно. Антидепресанти. Според наличните SPC, антипсихотиците и антидепресантите, използвани при починалия, са имали много ниска или неизвестна честота на удължаване на QT c. Освен това 14 (23%) случая на SUD са имали епилепсия и 10 (19%) са имали едно или повече антиепилептични лекарства в кръвта си (Таблица 2). Нито едно от лекарствата, използвани за лечение на епилепсия, не е имало известна честота на удължаване на QT c според наличните SPC.

Варианти с вероятен и неизвестен функционален ефект

Общо 21 (34%) индивида са имали 25 генетични варианта, които са класифицирани като вероятни да имат функционални ефекти (Таблица 3). Десет от тези варианти бяха нови. Средната възраст на пациентите с вероятни функционални ефекти е била 36 години (диапазон 1–49) и е включвала 11 мъже (52%). От вариантите с вероятен функционален ефект има 22 миссенс мутации и 3 глупости мутации (Таблица 3). Десет (40%) и 15 (60%) варианта бяха открити в гени, за които по-рано е установено, че са свързани с кардиомиопатии или сърдечни каналопатии. Седем от индивидите, които са имали варианти с вероятни функционални ефекти, също са имали варианти с неизвестен функционален ефект. Освен това 19 индивида носят само генетични варианти с неизвестен функционален ефект (данните за неизвестни варианти са дадени в Допълнителна таблица S2). Останалите 21 (34%) субекта не са имали вариант с вероятен или неизвестен функционален ефект.

Физическа активност по време на смъртта

Шест (10%) случая на SUD са починали по време на физическа активност. Четири от тях имаха варианти с вероятен функционален ефект. 39-годишна жена се срина при ходене и имаше вариант с вероятен функционален ефект в KCNJ8 (c.1066C> T, стр. (R356 *)). Преди това не е съобщавала за симптоми на сърдечно заболяване. Двама души са починали по време на гмуркане: 46-годишна жена, която е имала един вариант с вероятен функционален ефект в MYBPC3 (c.442G> A, стр. (G148R)) и друг в TNNC1 (c.433G> A, p ( D145N)) и 35-годишен мъж с вариант, който може да има функционален ефект в MYBPC3 (c.3742G> A, стр. (G1248R)). Двама водолази не съобщават за предишни симптоми, показващи сърдечно заболяване. 15-годишен мъж изведнъж рухна по време на футболно бягане. Той имаше един вариант с вероятно функционален ефект в CACNB2 (c.641G> C, стр. (S214T)), а другият в MYBPC3 (c.649A> G, стр. (S217G)). В миналото той е имал две събития на синкоп по време на футбол и когато е починал, е бил изследван за сърдечни заболявания. ЕКГ показа камерна екстрасистолия, но не беше поставена диагноза.

дискусия

Ние секвенирахме 100 гена, свързани със сърдечни заболявания в 61 датски случая на SUD, използвайки NGS. Един или повече варианти с вероятен функционален ефект са идентифицирани при 21 (34%) индивида. От 21 индивида, 12 са имали варианти с вероятни функционални ефекти изключително в гени, свързани преди това със сърдечно-йонна болест. Шест индивида са имали варианти с вероятни функционални ефекти изключително в гени, свързани преди с кардиомиопатични заболявания. Три индивида са имали варианти с вероятни функционални ефекти в гени, свързани с канюлопатия и кардиомиопатия.

Честотата на вариантите на гените, свързани с кардиомиопатията, е по-висока от очакваната. Кардиомиопатиите често са с различна експресия и с непълно проникване, а първоначалните фенотипни промени може да не са видими при аутопсия или да се считат за неспецифични или в рамките на нормалното. Вариантите, за които се съобщава, че са свързани с кардиомиопатии и структурни промени в сърцето, могат да доведат до аритмии - и в някои случаи медиирани от сърдечна дисфункция. Това се подкрепя от функционални изследвания на десмозомални гени, за които по-рано е доказано, че са свързани с ARVC. 3, 4, 5, 6 PKP2 генът за първи път е свързан с ARVC, когато Gerull et al 24 установяват, че има 25 варианта на PKP2 при 32 пациенти с ARVC. Варианти на PKP2 са намерени в

70% от всички случаи на ARVC. 4, 25 Наскоро беше установено, че PKP2 е свързан с BrS без структурни сърдечни аномалии. 3, 4 Cerrone et al 3 откриха варианти на PKP2 при 2,5% от изследваните пациенти с BrS. Следователно в това проучване се предполага, че PKP2 ще играе роля в трансфера на натриеви канали към интеркалирания диск чрез неизвестен механизъм. 3 Zhang et al. 4 откриха същия брой варианти на PKP2 при пациенти с ARVC и SUD с отрицателна аутопсия и стигнаха до извода, че внезапната смърт може да се дължи на аритмия чрез намалена локализация на Nav1.5 канални протеини към интеркалирания диск, като по този начин се увеличава разстоянието между плюс края на микротубулите и N-кадхерин централна плака. Установено е, че варианти в DSP и DSG2, които също са част от сърдечния десмозомален комплекс, са свързани с Nav1.5 дисфункция при мишки и HL-1 клетки. 5, 6 Саркомерни генни мутации са налице и в случаите на синдром на внезапна детска смърт (SIDS), при които не са наблюдавани структурни промени. Brion et al 26 са открили повече описани по-рано варианти на гените на саркомера при 286 жертви на SIDS. Те предполагат, че вариантите на гените на саркомера могат да бъдат причина за смъртта при тези деца, дори ако децата нямат структурни промени в сърцето.

В това проучване установихме, че две трети (40 индивида) от случаите на SUD имат варианти с неизвестни функционални ефекти или няма варианти с вероятни или неизвестни функционални ефекти. Причината за смъртта на тези лица все още остава без отговор и повдига нови въпроси; Има ли други гени или регулаторни елементи (метилиране, miRNA и др.), Които се откриват само в случаите на SUD и никога не присъстват при лица, живеещи със сърдечни заболявания? Би било интересно да се разследват допълнително тези случаи чрез секвениране на целия геном и изследване на епигенетични фактори.

Физическа активност по време на смъртта

Шест (10%) случая на SUD са починали по време на физическа активност, включително ходене, гмуркане, колоездене или футбол. Четири от тези шест индивида са имали варианти с вероятни функционални ефекти, три от които са били в MYBPC3. 46-годишният водолаз е имал преди това наблюдаван вариант на MYBPC3 (c.442G> A) при пациент с HCM. 35-годишният водолаз от мъжки пол е имал вариант на MYBPC3 (c.3742G> A), наблюдаван преди това при друг пациент с HCM 28 и класифициран като вероятно патогенен. 15-годишен футболист имаше варианти на MYBPC3 (c.649A> G) в проучването, където този вариант беше открит в два случая на SIDS и описан като потенциално патогенен. В друго проучване този вариант е открит при 19-годишна жена, която е имала сърдечен арест след стартиране и впоследствие е диагностицирана с HCM. В допълнение, вариантът е описан от същото проучване, както в предишния текст от Andreasen et al., 29, който установява, че този вариант има ниска честота и вероятно патогенен. И трите индивида с варианти на MYBPC3 с вероятен функционален ефект са изпълнявали леки до тежки упражнения по време на смъртта.

Внезапна неочаквана смърт при психиатрични заболявания и епилепсия

В тази група SUD 16 (26%) случая на SUD са имали психични заболявания според наличните медицински досиета (Таблица 2). При пет (31%) лица с психиатрично заболяване са идентифицирани един или повече варианти с вероятен функционален ефект. Открити са варианти в гените SCN5A, KCNQ1, TTN и LMNA. Разпространението на SUD при депресирани млади хора не е широко изследвано. Известно е, че средната продължителност на живота в Дания за пациенти с шизофрения е с 16-20 години по-кратка, отколкото за общото население. В скорошно проучване от Австралия, Sweeting et al. 32 установиха, че най-честата причина за смърт при пациенти с шизофрения са сърдечно-съдовите заболявания (23%) и че 11% от смъртните случаи са необясними след аутопсията.

Основните причини за SCD и SUD при психиатрични разстройства не са установени, но се предполага, че медикаментозните аритмии са важни при депресия 33 и шизофрения. 34, 35, 36, 37

Това проучване има някои ограничения. На първо място, това е силно подбрана кохорта, която потенциално намалява обобщаемостта на нашите открития. Трябва да се извършат функционални проучвания и анализи на сегрегацията в семейства, за да се проучат допълнително варианти с вероятни функционални ефекти. Генетичните находки в това проучване сами по себе си не могат да определят причината за смъртта, тъй като много от идентифицираните варианти са нови и се нуждаят от допълнително проучване.

В обобщение установихме, че една трета от мъртвите лица с отрицателна съдебномедицинска аутопсия са имали един или повече варианти с вероятно функционален ефект в гени, свързани с кардиомиопатии и сърдечни каналопатии. Освен това е установено, че 19 и 21 индивида имат само варианти с неизвестна значимост или никакви варианти на значимост. Нашите открития показват, че обширният генетичен скрининг с използване на NGS е полезна диагностична част от съдебно-медицинското разследване в случаи на SUD, при които не е възможно да се определи причината за смъртта след рутинна аутопсия. Тъй като значителна част от вариантите с вероятен функционален ефект са идентифицирани в гени, за които е установено, че са свързани с кардиомиопатии, предполагаме, че генетичните тестове на жертвите на SUD включват гени, участващи както в структурно, така и в неструктурно сърдечно заболяване. В допълнение, две трети от индивидите, при които не е идентифициран вариант с вероятен функционален ефект, ни карат да се чудим дали има други гени или регулаторни елементи, които тепърва трябва да се появяват при тези необясними смъртни случаи.