елементи

абстрактно

Функцията на гените за биосинтез на хатомарубигин беше анализирана чрез хетероложна експресия на hrb генния клъстер. Установено е, че Streptomyces lividans, носещ генен клъстер, състоящ се от 25 гена (hrbR1 - hrbX) с hrbY, произвежда всички известни хатомарубигини, включително хатомарубигин D, който има уникален димерен ангуциклин с метиленова връзка. В тази хетероложна експресионна система генното разрушаване се използва за анализ на функцията на hrbF, ген без хомология на известните гени за биосинтез на ангуциклин. Новият метаболит е открит във ферментирала среда на S. lividans, експресиращ hrb гени без hrbF и е обозначен като хатомарубигин F. Това съединение е идентифицирано като 5-хидроксихатомарубигин Е чрез ЯМР спектроскопски анализ, което показва, че HrbF регулира региоспецифичността на окислителните ензими.

Hatomarubigins A, B, C и D (Фигура 1), вещества, обратими на множество лекарства, са произведени от Streptomyces sp. 2238-SVT4. 1 Хатомарубигин Е и рубигинон В2 също са открити във ферментиралия бульон като биосинтетични междинни продукти. Тези съединения принадлежат към групата на ангуциклините, 3, 4, която се характеризира с това, че съдържа модифициран скелет на бенз [а] антрахинон. Сред тях хатомарубигин D е уникален димерен ангуциклин с метиленова връзка. В предишното ни проучване, 5 хатомарубигини, различни от хатомарубигин D, са произведени от Streptomyces lividans, носещ генен клъстер, състоящ се от 25 гена (hrbR1 - hrbX), за да идентифицират гена на клъстерния гърбица (Фигура 2) като гени за биосинтез на хатомарубигин. Такава хетероложна експресионна система е полезна за функционален анализ на неизвестни гени в клъстер. В това проучване всички известни хатомарубигини, включително хатомарубигин D, са произведени чрез хетероложна експресия на 25 hrb гени с hrbY, а хатомарубигин F, нов член на семейството на хатомарубигините, е изолиран от ферментирал мицел на S. lividans, носещ липсващия hrbF hrBF клъстер. .

анализ

Структури на хатомарубигини от А до Е и рубигинон В2.

Изображение в пълен размер

Генен клъстер за биосинтез на Hatomarubigin от Streptomyces sp. 2238-SVT4. Стрелките показват ДНК фрагменти, използвани за хетероложна експресия. Сивите кутии показват гени, хомоложни на известните гени за биосинтез на ангуциклин.

Изображение в пълен размер

Резултати и дискусия

Експресия на hrb генен клъстер, съдържащ hrbY в S. lividans

Нашето предишно проучване идентифицира HrbY като ензим, който може да превърне хатомарубигин С в хатомарубигин D в присъствието на метилкобаламин. За да потвърдим in vivo функцията на HrbY, ние конструирахме pWHM3-HR-Y, плазмид, носещ 25 hrb гени (hrbR1 - hrbX) с hrbY. Всички известни хатомарубигини, включително хатомарубигин D, бяха открити чрез HPLC анализ на ферментирал бульон от S. lividans, носещ pWHM3-HR-Y, въпреки че гените на S. bividans, експресиращи гърбични гени без гърбица, не произвеждат хатомарубигин D (Фигура 3). Тези резултати показаха, че HrbY е функционален in vivo и че генният клъстер на биосинтеза на хатомарубигин съществува в региона от hrbR1 до hrbR3, ген, хомоложен на ядрения регулатор (61% идентичност). 5

HPLC анализ на мицелиален екстракт от S. lividans, носещ pWHM3-HR5 ( а ); pWHM3-HR-Y ( б ); pWHM3-HR-YF ( ° С ) и pWHM3-HR-YFF-F ( д ). 1: хатомарубигин F, 2: хатомарубигин Б, 3: хатомарубигин А, 4: хатомарубигин С, 5: хатомарубигин Е, 6: хатомарубигин D.

Изображение в пълен размер

В експресията на клъстерния ген на hrb липсва hrbF в S. lividans

Гръбният клъстер на гърбиците съдържа няколко гена без хомология с известни гени за биосинтеза на ангуциклин (Фигура 2). Сред тях, hrbF кодира 234-аминокиселинен протеин, показващ малко сходство с биосинтеза на антибиотик монооксигеназа на S. griseus NBRC13350 SGR_5610 (34% идентичност) и биосинтеза на убихинон/менахинон метилтрансфераза от Caulobacter crescentus CB15 (34% идентичност). За да изследваме функцията на hrbF, ние конструирахме pWHM3-HR-YF, плазмид, който може да експресира hrb генен клъстер, в който липсва hrbF. Ферментиралият мицел на S. lividans, носещ pWHM3-HR-YF, съдържа всички хатомарубигини, което показва, че hrbF не е от съществено значение за биосинтеза на хатомарубигин. Когато HPLC профилите се сравняват с профили от S. lividans, експресиращи целия zhb генен клъстер hrb, се открива нов метаболит и пикът изчезва в трансформаторния бульон, който се въвежда в hrbF (Фигура 3). Това вещество е идентифицирано като нов член от семейството на хатомарубигините чрез спектроскопски анализ и е обозначено като хатомарубигин F ( 1 ).

Определяне структурата на хатомарубигин F (1) \ t

Маса в пълен размер

ЯМР анализ на хатомарубигин F ( 1 ). Удебелените линии показват COSZY мрежи, а стрелките показват HMBC.

Изображение в пълен размер

Streptomyces sp. 2238-SVT4 произвежда рубигинон В2, който може да се превърне в хатомарубигини А и В чрез окисляване до С-6 и С-11. В hrb клъстера два тандемни гена, hrbW и hrbX, кодиращи оксидоредуктаза и оксигеназа, участват в 11-хидроксилирането. Предполагаемата оксигеназа, отговорна за 6-хидроксилирането, се дължи на hrbG. Нарушаването на hrbF причинява оксигенация при анормална позиция C-5 и намалява производството на хатомарубигин А (Фигура 3), което предполага, че HrbF контролира региоспецифичността на тези окислителни ензими.

Експериментална секция

Бактериални щамове и ДНК манипулация

Средни и условия на растеж Streptomyces sp. 2238-SVT4 и S. lividans TK23 са описани по-горе. 1.5 Escherichia coli XL1-синьо MRF 'и JM110 бяха отгледани в LB среда, допълнена със 100 ug ml-1 ампицилин. KOD-plus ДНК полимераза (Toyobo, Osaka, Japan) е използвана за PCR амплификация в съответствие с инструкциите на производителя. Бяха извършени други общи процедури, както е описано в Sambrook et al. 8

Изграждане на плазмиди за клъстерна експресия

Фрагментът от 19,8 kbp, състоящ се от hrbR1 до hrbS (HR01), е конструиран, както е описано по-горе. 5.2 kbp фрагмент, състоящ се от hrbT до hrbX (HR02), се усилва от Streptomyces sp. 2238-SVT4 геномна ДНК, използвайки праймери с допълнителни Nsi I и Nhe I места (5'-TGCATGCATGTGCGAGAGCGCTGGACGCACGC-3 'и 5'-ACCGCTAGCTCAGACGGACAGCAGCCCGCGTGC-3'). 1,1-KBP гърбичният фрагмент (HR03) се амплифицира от геномна ДНК, като се използват праймери с допълнителни NheI и HindIII места (5'-ACCGCTAGCATGAGTGCAACAGTCGCGGTCGTC-3 'и 5'-ACCAAGCTTTCAGCCGGCGGTGGGCCGAACTG-3'). HR01 разцепва Xba I/Nsi I, HR02 разцепва Nsi I/Nhe I, разцепва HR03 с NheI/Hin dIII и разцепва pWHM3, разцепва XbaI/Hin dIII и се свързва към конструкцията pWHM3-HR-Y, плазмид, носещ hrbR1 до hrbX s. В този плазмид може да се транскрибира hrbA до hrbY.

Разрушаването на hrbF се извършва, както е описано по-долу. Фрагментът от 3,1 kbp Not I/Pst I, съдържащ hrbF, беше клониран в pBluescript II SK (+) (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Фрагмент от 1,2 kbp нагоре от hrbF се усилва от плазмида, като се използва праймер R13 M13 и праймер с друго място на Bln I (5'-AACCTAGGCGTCTTTCACTCCCGGTGTCGTCG) и се усвоява с NotI и Bln I. Фрагмент от 1,2 kbp след hrbF се усилва с M13 на праймер М4 и праймер с допълнително място на Bln I (5'-AGCCTAGGGCGCGCAGGTCGGCCCCAGAAGGA-3 ') и смилани с Pst I и Bln I. Тези два фрагмента бяха лигирани в Not I/Pst I, усвоени с pBluescript II SK (+), HrbF -делектиран 2.4 kbp фрагментът, получен чрез разграждане на плазмида Not I/Pst I, беше заменен с оригиналния фрагмент Not I/Pst I от 3.1 kbp на pWHM3-HR-Y, за да се конструира pWHM3-HR-YF. Фрагментът от 0,7 kbp hrbF беше амплифициран от геномна ДНК, като се използваха праймери с допълнителни Bln I места (5'-GACCTAGGATGCCTGTAGCCTCCGACGCCCCA-3 'и 5'-CGCCTAGGTCAGTCGGCTGTCTTCTCCAGCGC-3') същата ориентация към конструкцията на pWHM3-HR-YFF-F за допълнителен анализ на hrbF .

Хетероложна експресия на гени за биосинтез на хатомарубигин

Експресионните плазмиди, преминали през E. coli JM110, бяха въведени в S. lividans TK23. Трансформантите се инокулират в инокулатна среда, съдържаща 10,3% захароза, 3,0% глюкоза, 1,5% Bacto Soytone, 0,1% глицин, 3 mM CaCl 2, 5 mM MgCl 2 и 10 μg ml-1 тиострептон (рН 7, 2). След инкубация на бутален шейкър при 27 ° C, 2 ml от инокулатната култура се прехвърлят в 500 ml Erlenmeyer колби с 50 ml продукти, съдържащи 2,5% разтворимо нишесте, 1,5% соево брашно, 0,2% сушени дрожди, 0,2% 4% CaCO 3 и 10 μg ml-1 тиострептон (рН 6, 2). Ферментацията се извършва на ротационен клатач при 27 ° С в продължение на 2 до 3 дни. Ферментационният бульон се центрофугира и мицелът се екстрахира с ацетон. След изпаряване водният концентрат се екстрахира с етилацетат. Екстрактът се анализира чрез обратнофазова HPLC (YMC-Pack R-ODS-7, 4.6 mm x 250 mm; YMC, Киото, Япония) с 80% метанол. Пиковете на абсорбция за хатомарубигини са открити при 470 nm.

Изолиране на хатомарубигин F (1)

Мицелът се получава чрез центрофугиране на 2-дневна ферментирала среда (5 литра) от S. lividans TK23, носеща pWHM3-HR-YF, и се екстрахира с ацетон. Екстрактът се концентрира и разпределя между етилацетат и вода. Органичният слой се изпарява и се разтваря в хлороформ. Утайката се разтваря в метанол чрез добавяне на 10 обема хексан и се филтрува. Филтратът се подлага на HPLC (YMC-Pack D-ODS-7, 20 mm x x 250 mm; YMC) с 80% метанол-0,2% фосфорна киселина. Един от основните пикове (задържащ обем: 280 ml) се пречиства допълнително чрез HPLC (YMC-Pack D-ODS-7) със 75% метанол, съдържащ 5 mM натриев хидроген цитрат. Основната фракция (задържащ обем: 395 ml) се изпарява и водният концентрат се екстрахира с етилацетат. Екстрактът се промива с вода и се концентрира до сухо, за да се получи оранжев прах 1 (1,2 mg).

Физико-химични свойства на хатомарубигин F (1) \ t

276-278 ° С; EI-MS с висока разделителна способност m/z 340.0948 (M +, изчислено за C19H16O6, 340.0947); UV λ макс (λ) 224 nm (20 300), 287 nm (18 000), 475 nm (6800) в метанол, 226 nm (22 000), 287 nm (20 000), 474 nm (7000) в 01 M HCI-метанол, 240 nm (14 200), 310 nm (15 000), 534 nm (8300) в 0,01 M NaOH-метанол; IR (ATR) νmax 3438, 3127, 1619, 1568, 1449, 794 cm-1 .

Спектроскопски измервания

Мас спектрите бяха получени на спектрометър JMS-SX102A (JEOL Ltd., Токио, Япония) в режим EI. UV и IR спектрите бяха измерени на спектрометри Shimadzu UV-1700 и JASCO FT/IR-410. ЯМР спектрите са получени в DMSO-d6 на JEOL JNM-LA400 спектрометър с 1 H-NMR при 400 MHz и 13 C-NMR при 100 MHz. Химичните измествания се отчитат в ppm спрямо DMSO при 2,49 ppm за 1 H-NMR и при 39,5 ppm за 13 C-NMR.