елементи
абстрактно
Mycobacterium avium subsp. паратуберкулозата (MAP) и вирусът на Epstein-Barr (EBV) епитопите предизвикват постоянен хуморален отговор в серума на пациенти с множествена склероза, но кръстосаната реактивност срещу хомоложен миелинов основен протеин (MBP) и човешки интерферонов регулаторен фактор 5 (IRF5) не е при мозъчен спин CSF). Оценихме серума и CSF на пациенти с MS и други неврологични заболявания (OND) с хуморален отговор срещу EBV/MAP пептиди и IRF5/MBP. Нашите данни показват, че EBV и MAP пептидите са способни да индуцират специфичен хуморален имунен отговор при пациенти с МС в сравнение с OND контролите в серума и CSF. При пациенти с МС се наблюдава интратекален специфичен синтез на IgG срещу MBP и техните хомоложни EBV и MAP, както е посочено от индекса на антителата. Хуморалният отговор срещу EBV, MAP, MBP и IRF5 е значително по-висок при пациенти с МС в сравнение със серума и CSF OND. По-високото присъствие на антитела срещу MBP и техните MAP и EBV хомоложни в ликвора по време на рецидиви предполага възможна роля на патогените за увеличаване на възпалението.
резултатът
Съотношение CFS/серумен албумин и индекс на връзката
За всички проби индексът Link е оценен като общ маркер за интратекален синтез на IgG, съотношението CSF/серумен албумин (Q Alb) като маркер за целостта на BBB и процентът на пробите с различни видове увреждания на BBB и е показан в Таблица 1. Не са наблюдавани статистически значими щети при BBB. MS групите в сравнение с останалите групи, както се вижда от индекса Link и съотношението CFS/албумин.
Маса в пълен размер
Елиза
Абс срещу латентни и литични EBV протеини EBNA1 и BOLF1, MAP и човешки хомоложни пептиди се наблюдават в серума и CSF на пациенти с МС и в контролите IND, NIND, UND 5. Абс срещу EBNA1 400–413 са открити при 26 от 43 (60%) пациенти с МС, докато 3 от 17 (18%) контрола на IND, 2 от 11 (18%) NIND и само едно UND са положителни в серума (AUC = 0,74, p = 0,001) (Фиг. 1А). В CSF 17 от 43 (40%) МС, 3 от 33 (10%) IND, нито един от 11-те пациенти с NIND и 5 UND (AUC = 0,80, p = 0,001) не е установен за положителен (Фиг. 1В) . За MAP_106c 121–132, 27 от 43 (63%) пациенти с МС, 4 от 17 (24%) IND, 4 от 11 (36%) NIND и 1 UND са положителни (AUC = 0,73, p = 0, 008) в серума (фиг. 1С), докато 23 от 43 (54%) пациенти с МС, 3 от 17 (18%) IND, 2 от 11 (18%) NIND и никой от контролите на UND не отговори на MAP_106c 121–132 CSF (AUC = 0,71, p = 0,02) (фиг. 1D). Положителност към MBP 85-98 е установена при 27 от 43 (63%) пациенти с МС, 5 от 17 (29%) IND, 4 от 11 (36%) NIND и само едно UND в серума (AUC = 0, 71, p = 0,03) (фиг. 1Е). В CSF сред пациентите с МС наблюдаваме подобна ситуация, като 33% от МС, 27% IND, 10% NIND и 0% пациенти с UND показват MBP позитивност 85-98 (AUC = 0,7, p = 0,03) (Фиг. 1F ).
Четиридесет и трима пациенти, седемнадесет INDs, единадесет NIND и 5 UND бяха тествани за реактивност срещу EBNA1 400-413, MAP_0106c 121-132, MBP 85-98, серум ( A, ° С, Е. ) и CSF. ( Б., д, F ). Хоризонталните черни ленти представляват средната стойност, докато p стойностите са обозначени с две стрелки със стрелки, които се топят в горната част на всяко разпределение. Границите на положителността, изчислени чрез анализ на ROC, са обозначени с пунктирани линии.
Изображение в пълен размер
Четиридесет и трима пациенти, седемнадесет IND, единадесет NIND и 5 UND бяха тествани за реактивност срещу покрити със серум плочи от BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 и IRF5 424-434 ( A, ° С, Е. ) и CSF ( Б., д, F ). Хоризонталните черни ленти представляват средната стойност, докато p стойностите са обозначени с две стрелки със стрелки, които се топят в горната част на всяко разпределение. Границите на положителността, изчислени чрез анализ на ROC, са обозначени с пунктирани линии.
Изображение в пълен размер
Маса в пълен размер
Маса в пълен размер
Корелационни анализи
Извършени са корелационни анализи, за да се определи връзката между пептидната позитивност. Открихме добра корелация с пептида EBNA1 400-413 с хомоложния пептид MAP_106c 121-132 в серума (R2 = 0,57; P 2 = 0,4; p
Скатерна графика, показваща корелации между EBNA1 400-413 с MAP_0106c 121-132 в серум ( A ) в CSF ( Б. ). EBNA1 400-413 и MAP_0106c 121-132 със серумен MBP 85-98 ( С, Е ) в CSF ( D, F ) при пациенти с МС. Корелацията на Пиърсън е изчислена с помощта на Graph Pad 6.
Изображение в пълен размер
Също така открихме по-добра корелация между Abs срещу BOLF1 305-320 и MAP_4027 18-32 пептид в CSF (R2 = 0,54; p
Скатер, показващ корелации между BOLF1 305-320 с MAP_4027 18-32 в серум ( A ) в CSF ( Б. ). BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 със серумен IRF5 424-434 ( ° С, Е. ) в CSF ( д, F ) при пациенти с МС. Корелацията на Пиърсън е изчислена с помощта на Graph Pad 6.
Изображение в пълен размер
Състезателен тест
За да демонстрираме кръстосана реактивност между MAP/EBV и самите епитопи, ние разработихме два конкурентни анализа: едното MBP 85-98 покритие върху плочата и другото IRF5 424-434 покритие върху плаката (фиг. 5А, В, съответно). За състезателния тест с MBP 85-98 (фиг. 5А), при всички субекти на CSF (MS # 1, MS # 2 и IND), както EBNA1, така и MAP106 ефективно инхибират свързването на антитела с MBP-покрития пептид. В конкурентно изследване с IRF5 424-434 (фиг. 5В), както BOLF1, така и MAP 4027 ефективно инхибират свързването с IRF5 424-434, покрито при всички субекти на CSF (MS # 1, MS # 2 и IND), докато контролните пептиди MAP 2694 го правят не предизвиква никакво намаляване на сигнала (Фиг. 5А, В). Взети заедно, тези резултати показват, че Abs anti-EBNA1 и anti-MAP106 са насочени към един и същ конформационен MBP епитоп, а също така показват, че Abs anti-BOLF1 и anti-MAP 4027, насочени към един и същ конформационен IRF5 епитоп, са кръстосано реактивни в CSF.
Състезателен тест с покрити с MBP плаки ELISA ( A ) и IRF5 ( Б. ). ( A ) CSF от 2 пациенти с MS и 1 IND бяха предварително инкубирани за една нощ с насищащи концентрации от [10 μM] MAP2694 38-46 (отрицателна контрола), EBNA1 400-413, MAP 106 121-132 и MBP 85-98 (положителна контрола), Първата колона представлява обикновен ELISA (1: 2 CSF в PBS-T) пептид. ( Б. ) Същата CSF беше предварително инкубирана с MAP2694 38-46 (отрицателна контрола), BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 и IRF5 424-434 (положителна контрола). Първата колона представлява обикновен ELISA (1: 2 CSF в PBS-T) пептид.
Изображение в пълен размер
Индекс на пептидни IgG специфични антитела (AI) при пациенти с МС
Индексът на антителата (AI) за всички пациенти с МС се изчислява със следната формула AI = QlgG [спецификация]/Qlim 7. Големият брой положителни проби срещу избрани пептиди в групата с МС има AI> 1, 5, което показва интратекално IgG специфично производство на антитела срещу EBNA1 400–413, MAP 106, MBP 85–98 и BOLF1 305–320, MAP_4027 18– 32, IRF5 424-434 пептиди, както е показано в таблица 4.
Маса в пълен размер
дискусия
Точността на резултатите се потвърждава от корелационни резултати, фактът, че е установена тройна положителност в серума и ликвора срещу BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 и IRF5 424-434 при пациенти с МС в сравнение с отсъствието в IND/NIND/Субектите на UND потвърдиха нашата хипотеза, че MAP и EBV могат да запалят автоимунния процес при МС, а позитивността за различни пептиди (EBNA1 400-413, MAP_106c 121-132 и MBP 85-98) в CSF може да бъде свързана с МС на пациенти с рецидив в сравнение с пациенти с МС без рецидив.
Материали и методи
елементи
пептиди
Синтетични пептиди, получени от EBV антигени (BOLF1 305-320, EBNA1 400-413), MAP антигени (409-188, MAP_0106C 121-132) и човешки хомолози (MBP 85-98, IRF5 424-434) са включени в проучване 3, 4; пептидите се синтезират в търговската мрежа (LifeTein, South Plainfield, NJ 07080 USA) с чистота> 90% и се съхраняват замразени в аликвотни части за еднократна употреба [10 mM] при -80 ° C.
ELISA
Състезателен тест
Две MS и една IND CSF бяха подложени на ELISA на MBP 85-98 или IRF5 424-434 покрити плаки. Проведени са конкурентни анализи чрез предварително инкубиране на CSF за една нощ при 4 ° C с насищащи концентрации на пептиди [10 μM] (MBP 85-98; EBNA1 400-413; MAP 106) и (IRF5 424-434; BOLF1 305-320, Sero - отрицателен пептид (MAP 2694) е използван като отрицателна контрола [10 μM] и CSF ELISA, MBP 85-98 или IRF5 424-434 [10 μM] е положителен контрол.
IgG-специфичен индекс на антитела (AI)
Интратекалният синтез на EBNA1 400-413, MAP 106, MBP 85-98 и антитела, специфични за BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 и IRF5 424-434 IgG, се определя чрез индекс на антитела (AI) 7, 19, 20. Данните бяха нормализирани спрямо силната положителна контрола, включена във всички експерименти, чиято реактивност беше зададена на 10 000 произволни единици (AU)/ml. Индексът на антителата, включително концентрациите на серумен албумин и CSF, показва нормална кръвна/CSF бариера (QIgG [общо]> Qlim) 7. Използвахме следната формула: AI = QIgG [спецификация]/Qlim, тъй като с QIgG [спецификация] = IgGspec [CSF]/IgGs [серум] и Qlim 21 = 0,93 * √ (Qalb) 2 + 6 2 x 10 −6 - 1, 7 2 * 10 −3 7, 21 .
Статистически анализ
Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера GraphPad Prism 6.0 (Сан Диего, Калифорния, САЩ). P-стойностите, използвани за сравняване на различните категории в еднократния анализ, са изчислени чрез U-теста на Mann-Whitney. Разлики с п