МикроРНК са наскоро открит клас от естествено срещащи се къси некодиращи РНК молекули, които регулират отрицателно експресията на еукариотния ген чрез свързване към комплементарни последователности в 3'-UTR на целевата тРНК. Бързо се събират доказателства, които предполагат, че дисфункционалната експресия на микроРНК е често срещана характеристика на хематологичното злокачествено заболяване. 1 Въпреки това, с изключение на може би хроничната лимфоцитна левкемия (ХЛЛ), ролята на микроРНК при хематологични злокачествени заболявания не е добре известна; По-специално, анормално експресираните микроРНК в лимфома досега не са систематично идентифицирани. За да се справим с този проблем, използвахме анализ на микрочипове, за да се съсредоточим върху експресията на микроРНК в широк спектър от хематологични клетъчни линии (n = 40), включително всички основни видове В- и Т-клетъчни лимфоми (n = 29), доброкачествени лимфопролиферативни нарушения, персистираща поликлонална В-клетъчна лимфоцитоза (PPBL; n = 3), остра Т-клетъчна лимфобластна левкемия (T-ALL; n = 6) и остра миелоидна левкемия (AML; n = 2; Таблица 1). За да сравним тези проби с техните нормални клетки от произход, както и ролята на микроРНК в развитието на лимфоцитите, ние също изследвахме експресията в основните етапи на развитие на В-лимфоцитите и зрелите подгрупи на Т-клетките (n = 12; Таблица 1 ). ).

Маса в пълен размер

Пробите (приблизително 107 клетки) първо се пречистват във обогатени с микроРНК фракции, като се използват колони miREase от Qiagen (Crawley, UK) и 500 ng, маркирани с Cy3 или Cy5, като се използва комплектът Array 900microRNA RT от Genisphere (Hatfield, PA, USA). Тонзиларният материал, обединен от 12 здрави индивида, беше използван като общ референтен материал за експерименти, използващи цветово балансиран дизайн. Пробите бяха хибридизирани с микрочипове (μRNA микрочипове), които включват пълни набори от човешки и получени от EBV сетива на зрели микроРНК сонди (MirBase v.9.2), които бяха заредени на четворно несъседно. Последователностите на сондите са достъпни на www.microRNAworld.com. Чувствителността, специфичността и възпроизводимостта на полетата бяха тествани, както е описано (допълнителни фигури S1 - S3). Нивата на избрани микроРНК се измерват чрез количествена RT-PCR (qRT-PCR), както е описано по-горе, като се използва U6 като контрол.

развитие

Топлинна карта на човешката експресия на микроРНК в 40 хематологични клетъчни линии и 12 подгрупи лимфоцити, измерени чрез анализ на микрочипове. Подробности за клетъчните линии са дадени в Таблица 1. Извършен е неконтролиран клъстерен анализ при ниско нормализирано логаритмично съотношение (проба/референция) на нивата на експресия (средно от четири повторения). Разширената дендрограма се показва на страницата на термичната карта.

Изображение в пълен размер

Двадесет и седем микроРНК бяха идентифицирани като диференциално експресирани (модифицирани Р * и miR-96)) и бяха идентифицирани като силно експресирани в клетъчни линии като нормални проби от лимфоцити (Фигури 2а-в).

( а ) Нивата на експресия на микрочипове на микроРНК се експресират диференциално (модифициран Р4 и е силно експресиран в зрели В и Т клетки, където контролира прехода от про-пре-В клетки. Ramkissoon et al. 5 по-рано съобщават, че miR-223 не може да бъде открито чрез анализ на Northern. петно ​​в човешки В клетки, нашите резултати и резултатите от Landgraf et al.4 установяват, че тази микроРНК се експресира в нормални лимфоцити, но не и в В- или Т-клетъчни линии, с изключение на миелоидни клетъчни линии, последователни с ролята си в миелоидната диференциация (Фигура 2г). Въпреки това, Ramkissoon и сътр. 5 показват експресия на miR-223 в В клетки, когато се използва хибридизация на разтвора вместо техниката на по-ниска чувствителност и се установи, че miR-155 е неоткриваем от северния анализ и в двата В или Т клетки 5, но впоследствие се оказа важен регулатор в развитието на тези клетки.6 Чрез сравняване на експресионните профили на В и Т клетъчни подмножества бяха идентифицирани шест микроРНК като диференцирано експресирани (miR-92, miR-342, miR-559, miR -768, miR-146b и miR-125a). са по-силно изразени в Т-клетки, отколкото в В-клетки (Фигури 3а, d и e).

Нива на експресия на микрочипове микроРНК се експресират диференцирано (модифициран Р 6 В допълнение към miR-155, открихме, че активирането на В клетки in vitro чрез стимулация с IL-2 или IgM води до промени в експресията на единадесет микроРНК, повечето от които (9/11) бяха с регулиране, включително miR- 9. miR-7 и miR-132 (Фигури 2b aca 3b, fg) За разлика от тях, крайните етапи на развитие на В-клетките (памет/плазмени клетки) бяха свързани с понижаването на регулацията (10/11) на диференциално експресирани микроРНК, включително miR-181a, който по подобен начин намалява отговора към съзряването на Т-клетките (Фигури 3в и 3). Интересното е, че три от тези микроРНК, miR-17, miR-20b и miR-106a, също са идентифицирани като увеличени при активиране на В-клетките. Тези микроРНК също са част от клъстера 17-92, което предполага неизвестна досега функция за този клъстер в диференциацията на В-клетките.

Въпреки че микроРНК профилите на клетъчните линии до голяма степен отразяват диагнозата, има много малко кандидат-микроРНК, чиято експресия е ясно свързана със специфична диагноза, което предполага, че отделните микроРНК могат да бъдат ограничени до класификация на лимфома. Единственото изключение беше miR-148a, който беше силно експресиран в миелом, но не и в други В- или Т-клетъчни линии или лимфоцити (Фигури 4в и h). Малко се знае за miR-148a, въпреки че е установено, че той е увеличен при колоректални тумори, съдържащи активиращи KRAS мутации. Такива мутации са често срещани при миелом, но рядко при неходжкинов лимфом. В допълнение, тази микроРНК се намира в непосредствена близост до HOX A клъстера, който е важен регулатор на хематопоезата, който е аберантно изразен в AML и миелом. Интересното е, че една от целите на miR-148a, обща за множество алгоритми за прогнозиране (PicTar, TargetScan и miRanda), е MAFB, често срещана генетична лезия при миелома. Други микроРНК са свързани не изключително с диагностична класификация, като miR-153, която, макар и силно експресирана в HL, но не и в други В-клетъчни линии или лимфоцити, също е била регулирана в T-ALL клетъчни линии (Фигури 4д и i ).

Нивата на експресия на микрочипове микроРНК се изразяват диференцирано (модифициран P 2 установява, че клетъчни линии от тип ABC (OCI-Ly3, OCI-Ly10, HLY-1 и HBL-1) и клетъчни линии от тип GCB (SU-DHL4, SU-DHL6 и SU- DHL10) бяха ясно групирани (Фигура 1), с miR-155, miR-221, miR-222 и miR-21, регулирани в ABC клетъчни линии, и ние разширихме тези открития до miR-363 и miR-518a (които не бяха включени Също така идентифицирахме микроРНК, които бяха регулирани в клетъчни линии от тип GCB, включително miR-181a, miR-590, miR-421 и miR-324 (фигури 4m и n) и сме в процес на изследване на нивата на експресия на тези микроРНК в клинични образци на DLBCL, както беше демонстрирано по-рано, по-високи нива на miR-155, miR-21 и miR-221 са свързани с ABC имунофенотип при пациенти.

За да сравним хематологичните злокачествени заболявания с доброкачествени нарушения, ние изследвахме лимфобластоидни клетъчни линии, получени от PPBL лимфопролиферативно разстройство. Тези клетъчни линии показаха значително регулиране на miR-132 и miR-155, докато miR-550 и miR-641 бяха понижени (Фигури 4b и g). Интересното е, че е установено, че както miR-132, така и miR-155 са индуцирани от ендотоксинова стимулация, вероятно отразяваща връзката с тежкото пушене, характерна за това разстройство.

Нива на експресия на получени от EBV микроРНК в заразени с EBV клетъчни линии, измерени чрез микрочипове. За съображения за сравнение беше включена EBV-клетъчната линия Ramos.

Изображение в пълен размер

Интересното е, че експресията на miR-155 в BL е свързана и с EBV латентност тип III инфекции. В съответствие с тази идея открихме, че miR-155 се изразява силно в клетъчните линии PPBL Raji и Granta-519, но не и в клетъчната линия EBV-BL Ramos или YT клетъчната линия, заразени с латентност тип II. Въпреки това, както вече споменахме, не намерихме експресия на тази микроРНК в Daudi. Това може да се дължи на ненормалния характер на EBV инфекцията в тази клетъчна линия, която има делеция, включително EBNA2 и част от EBNA5 и не изразява LMP.

Докато други изследвания на производството на микроРНК включват някои хематологични клетъчни линии и/или подмножества на лимфоцитите, 4, 5 до момента е най-изчерпателното изследване на експресията на микроРНК при лимфоидно развитие и злокачествено заболяване до момента. Наскоро Landgraf и сътр. 4 клонирани и секвенирани 256 малки РНК библиотеки, съдържащи 98 хемопоетични библиотеки. Въпреки че не е пряко еквивалентно, сравнение между деветте често срещани клетъчни линии показа сходни модели на експресия (допълнителна фигура S4).

Поради липсата на функционална информация, налична за повечето от идентифицираните микроРНК, тяхната роля в развитието на лимфоцитите и злокачествеността може да бъде реализирана само чрез бъдещи разследвания, където това проучване ще се окаже ценна отправна точка.