абстрактно

Да се ​​изследва експресията на антиапоптотични и проапоптотични маркери в диабетни ретини.

методи

Като контролни субекти бяха изследвани общо 12 очи от шест пациенти със захарен диабет и 10 очи от пет пациенти без диабет без известно очно заболяване. Използвани са имунохистохимични техники с антитела, насочени срещу циклооксигеназа-2 (Cox-2), Akt (протеин киназа В), Mcl-1, Bad, цитохром с, фактор, индуциращ апоптоза (AIF), смърт, свързана с протеин рецептор-1 на тумор некроза фактор (TRADD) и Fas-асоцииран смъртен протеин (FADD).

резултатът

В ретините на всички пациенти без диабет се наблюдава цитоплазмена имунореактивност в ганглиозните клетки за антиапоптотичните молекули Cox-2, Akt и Mcl-1. Цитоплазматично имунооцветяване за Cox-2 също е съобщено в пигментните епителни клетки на ретината. Съобщава се за слаба имунореактивност на митохондриалните апоптогенни протеини цитохром с и AIF във вътрешните сегменти на фоторецепторите, във вътрешната трета на външния плексиформен слой, в клетките във вътрешния ядрен слой, във вътрешния плексиформен слой и в ганглия. клетки. Нямаше имунореактивност за останалите тествани антитела. Всички диабетни ретини показват de novo цитоплазматична имунореактивност за Bad в ганглиозни клетки и случайни клетки във вътрешния ядрен слой. Съобщава се за повишена имунореактивност на цитохром с и AIF. Имунореактивността на Cox-2, Akt и Mcl-1 не се променя при диабетни ретини. Няма имунореактивност за TRADD и FADD.

заключения

Ганглиозните клетки при диабетни и недиабетни ретини експресират антиапоптотичните молекули Cox-2, Akt и Mcl-1. Ганглиозните клетки на ретината експресират проапоптотичната молекула Evil в отговор на невронално увреждане, предизвикано от диабет. Диабетните ретини показват повишено регулиране на митохондриалните цитохром с и AIF протеини.

Основното

Клетъчната смърт чрез апоптоза, строго контролирано събитие под контрола на генетични програми, изглежда играе важна роля в развитието и патогенезата на диабетните усложнения. Няколко проучвания in vitro и in vivo показват, че оксидативният стрес, предизвикан от хипергликемия, води до оксидативно увреждане на невроните, което от своя страна активира пътищата на смъртта, свързани с невроналната апоптоза. 1, 2, 3 ретини на диабетни плъхове показват повишен оксидативен стрес и приложението на антиоксиданти инхибира развитието на ретинопатия. 4, 5, 6 Напоследък се документира повишена апоптоза на нервните ретинални клетки при експериментален диабет при плъхове и захарен диабет при хора. Тази клетъчна смърт чрез апоптоза води до хронична невродегенерация, при която невроните се губят в диабетните ретини, преди да може да се открие друга хистопатология. 7, 8

Молекулярните механизми, които регулират преживяемостта на невроните и апоптозата на ретината при хора със захарен диабет, не са напълно идентифицирани. В предишно проучване демонстрирахме, че ганглиозните клетки в диабетните ретини експресират фактори, насърчаващи апоптозата на каспаза-3, Fas и Bax, което предполага, че тези клетки са най-уязвимата популация. Идентифицирани са редица други медиатори, които са или антиапоптотични, или проапоптотични. Те включват, но не се ограничават до, серин/треонин протеин киназа Akt (известна също като протеин киназа В), циклооксигеназа-2 (Cox-2), Mcl-1, Bcl-2-асоцииран промотор на смърт (Bad), цитохром c, апоптоза. индуциращ индукционен фактор (AIF), тумор некротизиращ фактор-1, свързан с рецептора домен смъртния протеин (TRADD) и Fas-асоцииран смъртен протеин (FADD).

Доказано е, че Akt защитава невронните клетки от апоптоза, като влияе върху активността на няколко транскрипционни фактора, участващи в регулирането на клетъчното оцеляване. 11, 12, 13, 14, 15, 16 Няколко проучвания показват, че Cox-2 функционира като фактор за оцеляване чрез защита на клетките от апоптоза. 17, 18, 19, 20, 21 Свръхекспресията на Mcl-1, член на семейството Bcl-2, 22, забавя апоптозата с голямо разнообразие от агенти. 18, 21, 23, 24, 25, 26 Злото е проапоптотичен член на семейството гени Bcl-2, който насърчава апоптозата чрез свързване и инхибиране на функциите на антиапоптотичните протеини Bcl-2 и Bcl-xL. Митохондриите играят ключова роля в контрола на апоптотичната клетъчна смърт. В началото на апоптотичния процес митохондриите могат да освободят няколко апоптотични протеини в цитозола, като цитохром с и AIF. 27, 28 Доменът на смъртта, съдържащ адаптерите TRADD и FADD, действа като ключови протеини в механизма на програмирана от лиганда индуцирана клетъчна смърт (апоптоза), получена от Fas рецептори (CD 95/APO-1) и рецептор за туморна некроза тип 1. Набиране на каспаза-8 чрез TRADD и FADD води до активиране на каспаза и последваща апоптоза. 29

Идентифицирането на молекулярни механизми, които регулират апоптозата на нервните клетки при диабетни ретини, е полезно за разработването на терапевтични стратегии, които могат да осигурят начин за забавяне или предотвратяване на настъпването на смърт на нервните клетки на ретината при пациенти с диабет. Затова използвахме имунохистохимични техники за изследване на експресията на маркери, свързани с апоптоза на Akt, Cox-2, Mcl-1, Bad, цитохром c, AIF, TRADD и FADD в ретините на пациенти с диабет и в ретините на пациенти без диабет .

методи

Проучване на популацията

Получихме 12 човешки очи от донор след смъртта от шест индивида със захарен диабет. В миналото никой субект не е имал фотокоагулация на ретината. Също така получихме 10 очи от пет индивида без анамнеза за диабет или очни заболявания, както е определено от груб патологичен преглед. Очите на донора са получени и използвани в проучването в съответствие с разпоредбите на Декларацията от Хелзинки за изследване на човешките тъкани. Веднага след пристигането на пробите в лабораторията беше направен 3 mm разрез в задната част на лимба и роговицата, ирисът, лещата и стъкловидното тяло бяха внимателно отстранени. Ретината и увеалната тъкан бяха отделени от околната тъкан, фиксирани в 4% параформалдехид и вградени в парафин.

Имунохистохимично оцветяване

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

Пропускането или заместването на първичното антитяло с неподходящо антитяло от същия вид и оцветяването само с хромоген се използват като отрицателни контроли. Като положителни контроли бяха използвани секции от пациенти с колоректален рак и рак на гърдата. Секции от контролни пациенти са получени от пациенти, лекувани в университетска болница (Университет в Льовен, Белгия) в пълно съответствие с принципите на Декларацията от Хелзинки.

Всички секции бяха изследвани от двама независими наблюдатели (AMA, KG). Един от тях (KG) не е знаел за произхода на пробите. В случай на несъгласие бяха използвани резултатите на заслепен наблюдател. Разминаването между двамата наблюдатели беше по-малко от 5%. Оцветяването се класифицира въз основа на наличието или отсъствието на имунореактивност, интензивността на имунореактивността, дебелината на оцветяването и хомогенния или хетерогенния характер на оцветяването.

резултатът

Възраст и пол на донора, тип диабет, продължителност на диабет, наличие или отсъствие на артериална хипертония, статус на ретинопатия, причина за смъртта и времена на смърт за енуклеация са обобщени в Таблица 3. Непролиферативната диабетна ретинопатия е документирана в два случая. дела (случаи 1 и 2). Статусът на ретината е бил неизвестен в три случая (случаи 3, 4 и 5). Няма хистопатологични промени в тези очи, предполагащи диабетна ретинопатия. Един случай (случай 6) не е имал ретинопатия.

Маса в пълен размер

диабетни

Микрография на ретината на пациент с диабет. Слайдът за отрицателна контрола, който се третира идентично с неподходящото антитяло, не показва маркиране. NFL, слой от нервни влакна; GCL, ганглиозен клетъчен слой; IPL, вътрешен плексиформен слой; INL, вътрешен слой на сърцевината; OPL, външен плексиформен слой; ONL, външен сърцевинен слой; IS, вътрешни сегменти на фоторецепторни клетки; OS, външни сегменти на фоторецепторни клетки; RPE, пигментен епител на ретината. (Оригинално увеличение × 100).

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Микрофотографии на ретината от недиабетно лице, имунооцветено за циклооксигеназа-2, показващо имунореактивност в ганглиозни клетки (стрелки) (а) и фактор, предизвикващ апоптоза, показващ имунореактивност във вътрешните сегменти на фоторецепторите, във вътрешната една трета от външната трета в плексиформния слой, в клетъчната ядрена слой, вътрешен плексиформен слой и ганглиозни клетки (b). Съкращенията са дефинирани на фигура 1 легенда. (Оригинално увеличение × 100).

Изображение в пълен размер

Подобни находки са докладвани при всички диабетни ретини. De novo цитоплазмена имунореактивност за Bad се наблюдава в ганглиозни клетки и в няколко клетки във вътрешния ядрен слой (Фигура 3а). Повишено регулиране на гранулирания цитохром с и AIF имунореактивност се наблюдава във вътрешните сегменти на фоторецепторите, във вътрешната една трета от външния плексиформен слой, в клетките във вътрешния ядрен слой, във вътрешния слой на плексиформата и в ганглиозните клетки. Фигура ЗЬ показва представителен резултат от експресията на тези протеини. Разпределението и интензивността на имунореактивността за Cox-2, Akt и Mcl-1 не се променят при диабетните ретини в сравнение с ретините от пациенти без диабет. Няма имунореактивност за TRADD и FADD.

Микрофотографии на ретината от пациент с диабет, имунооцветени за Bad, показващи имунореактивност на ганглиозни клетки (стрелки) (а) и фактор, предизвикващ апоптоза, показващ повишаване на имунореактивността на фактора, индуциращ апоптоза (b). Съкращенията са дефинирани на фигура 1 легенда. (Оригинално увеличение × 100).

Изображение в пълен размер

дискусия

В това проучване демонстрирахме следните точки: (1) ганглиозни клетки на ретината, конститутивно експресирани антиапоптотични молекули Akt, Cox-2 и Mcl-1; (2) индуцирана от диабет de novo експресия на проапоптотичната молекула Evil в ганглиозни клетки на ретината; и (3) диабетни ретини показаха регулиране на митохондриалния цитохром с и AIF протеини.

Изглежда, че серин/треонин протеин киназа Akt, фосфатидилинозитол (PI) 3-киназен ефектор (PI 3-киназа), играе ключова роля за посредничеството за оцеляване на невроналните клетки и невропротекция. Orike и сътр. 11 показа, че оцеляването на симпатиковите неврони при възрастни при липса на невротрофични фактори зависи от сигнализирането на PI 3-киназа/Akt. Няколко проучвания показват, че пътят PI 3-киназа/Akt играе основна роля в медиирането на отговора на оцеляването на ганглиозните клетки на ретината след аксотомия към различни растежни фактори. 12, 13, 14 В допълнение, апоптозата на невроните на ретината, индуцирана от серумна депривация, се намалява чрез инсулин чрез активиране на PI 3-киназния/Akt път. В допълнение, сигналната пътека на PI 3-киназата/Akt на ретината се активира чрез притискане на зрителния нерв и има невропротективен ефект върху увредените ганглиозни клетки на ретината. 16 В съответствие с нашите резултати, имунореактивността на фосфорилирания Akt беше открита в ганглиозните клетки на ретината в увредената ретина. 16.

Кокс ензимите медиират производството на простагландини от арахидонова киселина. Идентифицирани са две изоформи на Cox, Cox-1 и Cox-2. Cox-1 се експресира конститутивно в повечето тъкани и се смята, че е отговорен за поддържането на нивата на простагландин за различни домашни функции. За разлика от това, Cox-2 е продукт на непосредствения ранен ген, който е бързо индуцируем и строго регулиран. Експресията на Cox-2 може да бъде индуцирана в различни тъкани чрез патологични стимули, като бактериални липополизахариди, провъзпалителни цитокини, растежни фактори, хормони и туморни промотори. Въпреки че се нарича индуцируема изоформа, Cox-2 се експресира конститутивно в мозъка, гръбначния мозък, тестисите, трахеалния епител и бъбречния макулен денс. В тези тъкани Cox-2 присъства без очевидни стимулиращи процеси и се счита за доминиращата изоформа на Cox. Доказано е, че Cox-2 допринася конститутивно за физиологичната регулация и развитие в тези силно диференцирани органични системи. 17

Последните данни показват, че Cox-2 и простагландини, произтичащи от ензимното му активиране, участват в контрола на клетъчния растеж, ангиогенезата, апоптозата и развитието на неоплазия. Селективен инхибитор на Cox-2, атенюирал ангиогенезата на ретината, който съпътства ретинопатията на недоносените бебета и нормалното развитие на ретината. Тези открития показват, че Cox-2 играе важна роля както в развитието, така и в патологичната ангиогенеза на ретината. В допълнение, няколко проучвания предполагат роля на Cox-2 в невроналната функция в мозъка. 32, 33 В допълнение, няколко проучвания демонстрират пряка роля на Cox-2 в осигуряването на устойчиви на апоптоза клетки чрез увеличаване на експресията на Mcl-1 чрез активиране на PI 3-киназа/Akt-зависим път. 18, 21 В това проучване се наблюдава цитоплазмена имунореактивност за Cox-2 в ганглиозни клетки на ретината, пигментни епителни клетки на ретината и пигментирани и непигментирани слоеве на цилиарния епител на тялото в диабетна и недиабетна ретина, потвърждавайки предишни доклади. 31, 34, 35, 36 Експресия на антиапоптотични молекули Akt, Cox-2 и Mcl-1 в ганглиозни клетки на ретината може да отразява факта, че невроните са склонни да се поддържат през целия живот на индивида.

В това проучване Bad се изразява в ганглиозни клетки и в няколко клетки във вътрешния ядрен слой при диабетни ретини. Тези наблюдения предполагат, че ганглиозните клетки на ретината увеличават лошата експресия в отговор на индуцирано от диабет увреждане на невроните. Подобни наблюдения са описани от Chen et al. 37, който демонстрира, че индуцираната от невротоксин дегенерация на невроните на ретината индуцира de novo Лоша експресия в ганглиозните клетки на ретината. В допълнение, преходна ретинална исхемия чрез централна артериална оклузия на ретината индуцира регулиране на лошата експресия в клетките в ганглийния клетъчен слой и вътрешния ядрен слой. 38

Няколко проучвания in vitro и in vivo показват, че оксидативният стрес, предизвикан от хипергликемия, е тясно свързан с апоптозата при различни клетъчни типове. Оксидативният стрес участва в нарушената митохондриална функция и активирането на програмирания път на смърт на клетъчната каспаза в диабетните неврони. 1, 2, 3 Съществуват обширни доказателства за участието на реактивни кислородни видове в задействането на митохондриите за освобождаване на няколко основни играчи на апоптоза, като цитохром с и AIF, в цитозола. 28, 49 Няколко проучвания показват, че оксидативният стрес се увеличава в ретината с диабет и се смята, че играе важна роля в развитието на диабетна ретинопатия. 4, 5, 6 Администрирането на антиоксиданти инхибира активирането на ензима, предизвикващ апоптоза каспаза-3 и инхибира развитието на ретинопатия. 5, 6 Напоследък са показани индуцирана от диабет митохондриална дисфункция на ретината и повишено освобождаване на цитохром с в цитозолната фракция, приготвена от ретината на плъх. 50

Въпреки че тези наблюдения, поради описателния си характер, не позволяват точно разбиране на функцията на тези молекули, те предполагат, че ганглиозните клетки на ретината имат защитни механизми за защита срещу апоптоза, че ганглиалните клетки на ретината изразяват лошо в отговор на неврони, индуцирани от диабет. и че диабетните ретини показват регулиране на митохондриалните протеини като цитохром с и AIF.