адипонектин

  • абстрактно
  • целта:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • методи
  • елементи
  • Антропометрични измервания
  • Оценка на телесния състав
  • Биохимични анализи
  • Биопсии на мазнини и екстракция на иРНК
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • дискусия
  • Ограничения за проучване

абстрактно

Регулаторните процеси, които модулират производството на адипонектин, и механизмите, участващи в транскрипционната активност на ядрения фактор κB (NF-κB) в човешките адипоцити, все още не са напълно изяснени. Целта на нашето проучване беше да се оцени взаимовръзката между телесните мазнини, разпределението на мазнините, системното възпаление, инсулиновата резистентност, лептин и нивото на гените за генна експресия в серума и подкожната тъкан на тумор некрозис фактор алфа (TNF-α), адипонектин и капа В-алфа инхибитор (IkB-a), при пациенти с широк диапазон на индекса на телесна маса (ИТМ). Също така искахме да определим коя от тези променливи е най-свързана с експресията на гена на адипонектин и капацитета за транскрипция на адипоцитите на NF-kB.

методи:

Проучени са общо 27 жени на възраст от 50 до 80 години с ИТМ в диапазон от 22,1 до 53,3 kg/m2. При всички пациенти ИТМ, обиколка на талията, телесен състав чрез двойна рентгенова абсорбтометрия, триглицериди, холестерол, липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-Ch), глюкоза, инсулин, модели на хомеостаза, оценка на инсулинова резистентност (HOMA), силно чувствителна С реактивна бяха изследвани протеини (hs-CRP), серумен адипонектин, лептин и TNF-a. Били са взети биопсии на подкожната мастна тъкан от корема на всички субекти и са определени нивата на адипонектин, TNF-α и IkB-α иРНК.

резултатите:

ИТМ и обиколката на талията са положително свързани с лептин, HOMA и hs-CRP и отрицателно с HDL-Ch; лентата също е свързана с адипонектин и IkB-α иРНК. HOMA е отрицателно свързан със серумен адипонектин и иРНК на адипонектин. Hs-CRP е отрицателно свързан с IkB-α mRNA и е позитивно свързан с HOMA. За да се определят комбинираните ефекти на ИТМ, обиколка на лентата, триглицериди, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, лептин, серум и TNF-α иРНК върху експресията на гена на адипонектин, беше извършен анализ на множество регресии: обиколката на лентата и лептин бяха включени в най-подходящото уравнение за регресия, за да се предскаже експресията на гена на адипонектин (R2 = 0,43, P = 0,006). Извършен е последователен анализ на множествена регресия, като IkB-α mRNA се счита за зависима променлива, а като независими променливи се използват BMI, лента, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP и adiponectin mRNA. MRNA на адипонектин е единствената променлива, която регресира (R2 = 0.406, P1.2). Показано е, че не всички индивиди със затлъстяване имат високи нива на С-реактивен протеин (CRP), а само тези, които са резистентни към инсулин.3, което предполага силна връзка между инсулиновата резистентност и възпалението.

Мастната тъкан изразява няколко гена, които кодират секреторни протеини с широк спектър от ефекти: 4 нарастващи доказателства подкрепят идеята, че секреторните продукти на адипоцитите участват в механизъм, който съчетава затлъстяването и инсулиновата резистентност, като някои подобряват чувствителността към инсулин, а други го подобряват. В допълнение, някои от тези адипоцитокини имат противовъзпалителен ефект, докато други са противовъзпалителни. 4, 5

Адипонектинът е сравнително наскоро открит специфичен за мастната тъкан протеин, сенсибилизиращ инсулина, има противовъзпалителен ефект от 4, 5, 6, 7 и има по-ниски плазмени концентрации при пациенти със затлъстяване, отколкото при бедни индивиди. 4, 5, 6, 8 Връзката между адипонектин и инсулинова чувствителност е по-силна от връзката между адипонектин и адипозност. 9 Наблюдава се отрицателна връзка между адипонектин и CRP. 10, 11 Връзката между възпалителни маркери, инсулинова резистентност, лептин, коремно затлъстяване и експресия на гена на адипонектин все още се обсъжда.

Тези взаимоотношения изглеждат особено важни, тъй като наскоро беше показано, че адипонектинът може да действа като локален възпалителен регулатор в подкожните мъжки свински подкожни адипоцити, където действа чрез инхибиране на ядрения фактор kB (NF-kB). 12

NF-kB се задържа в цитоплазмата чрез взаимодействия с инхибиторни протеини от семейството на капа В (IκB) инхибиторен фактор. 13, 14 В отговор на широк спектър от клетъчни стимули, IκB-α се отделя от NF-κB комплекса и след това се разгражда протеолитично. Този процес включва фосфорилиране на IκB-α от членове на семейството на IκB киназа (IKK). Разграждането на IκB-α води до „активиране“ на NF-κB, което се определя като транслокация на NF-κB комплекса от цитоплазмата към ядрото. Попадайки в ядрото, NF-кВ се свързва със специфични ДНК промоторни елементи и индуцира транскрипция на съответни гени, включително провъзпалителни цитокини, няколко хемокини и много молекули на съдова ендотелна клетъчна адхезия 13, 14 (Фигура 1).

Механизъм на активиране на NFκB.

Изображение в пълен размер

Доказано е, че възпалителните стимули като ендотоксин и цитокини индуцират повишаване на вътреядрения NF-kB, докато противовъзпалителните агенти причиняват повишаване на експресията на IκB-α и нивата на протеини. 15, 16

Въпреки това, механизмите, които регулират активността на NF-κB в човешките адипоцити, все още са неизвестни. Предполага се, че адипонектинът може да има локален противовъзпалителен ефект чрез увеличаване на експресията и нивото на IκB-α протеин в адипоцита.

Целта на нашето проучване беше да се оцени взаимовръзката между телесните мазнини, разпределението на мазнините, системното възпаление, инсулиновата резистентност, нивата на експресия на лептин и TNF-α, адипонектин и IkB-α в серума и подкожната мастна тъкан при пациенти с широк диапазон от индекс на телесна маса (ИТМ) и да се определи кои от тези променливи са най-подходящи за експресията на гена на адипонектин и транскрипционната сила на адипоцитите NF-κB.

За да оценим системното възпаление, измерихме hs-CRP, добре приет сурогат, докато активността на NF-κB беше оценена чрез определяне на генната експресия на неговия цитоплазмен инхибитор IκB-α.

методи

елементи

Проучени са общо 27 жени на възраст от 50 до 80 години с индекси на телесна маса (ИТМ), вариращи от 22,1 до 53,3 kg/m2.

Всички пациенти са били в добро здравословно състояние, както се определя от пълна медицинска история, физически преглед, както и нормална кръвна картина, батерия за химически тест и анализ на урината. Всички индивиди са с стабилно тегло през предходните 6 месеца и нямат данни за рак, черен дроб, бъбреци или щитовидна жлеза. Седем жени са имали нарушен глюкозен толеранс, а две жени са имали диабет тип 2 според критериите на Асоциацията на Американската диабетна асоциация. 17 Нито един от субектите не е получавал инсулин, тиазолидиндиони, антихипогликемични или анти-мастни лекарства, нито редовно е приемал противовъзпалителни лекарства. Всички са били в постменопауза и не са били на хормонозаместителна терапия. Никой от участниците не участва редовно във физически дейности.

Всички участници дадоха информирано съгласие и експерименталният протокол беше одобрен от комисията по етика на нашия университет.

Антропометрични измервания

За субекти с леко вътрешно облекло и без обувки телесното тегло беше измерено с точност до 0,1 kg (скала на Salus, Милано, Италия) и височина с точност до 0,5 cm с помощта на стадиометър (Salus stadiometer, Милано, Италия). ИТМ се изчислява като телесно тегло, коригирано спрямо квадрата (kg/m2). Обиколката на лентата е получена с помощта на измервателна лента като минимална обиколка между ксифоидния процес и пъпната връв.

Оценка на телесния състав

Съставът на тялото е измерен чрез двуенергийна рентгенова абсорбционна спектрометрия (DXA) (Hologic QDR 4500, Waltham, MA, USA).

Характеристиките и физическите концепции на DXA измерването са описани другаде. Ежедневно се провеждаха 18 теста за осигуряване на качеството според инструкциите на производителя. Впоследствие всички сканирания бяха анализирани от един обучен изследовател. Общата телесна мазнина се изразява в kg (FM) и като процент от телесното тегло (FM%). Чистата маса на меките тъкани (FFM) се счита за общо телесно тегло минус сумата от общата телесна мазнина и костна маса и се изразява в kg. Коефициентът на вариация (CV) за двойно определяне при 11 пациенти (жени на възраст 66-77 години) е 1% за FM, 2,3% за FM% и 1,3% за FFM.

Биохимични анализи

Взети са проби от венозна кръв за всички метаболитни определяния след гладуване през цялата нощ. Плазмената глюкоза се измерва с помощта на глюкозен анализатор (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA). Интра-тест CV е 1,5%.

Имунологично реактивният плазмен инсулин се подлага на дублирани измервания чрез радиоимуноанализ с двойно антитяло, използвайки търговски комплект (Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA). Чувствителността е 6 pmol/l, а CV в теста е 4,9%.

Инсулиновата резистентност беше оценена по метода HOMA (оценка на хомеостазата на инсулинова резистентност). 19.

Нивата на холестерола и триглицеридите се определят с помощта на Technicon Auto анализатор (Technicon Inc., Co., Tarrytown, NY, USA) и декстран-магнезиевото утаяване се използва за отделяне на липопротеини с висока плътност (HDL).

Серумният лептин се измерва с помощта на специфичен комплект ELISA (DBC-Diagnostic Biochem Canada Inc., Лондон, Онтарио, Калифорния). Чувствителността е 0,5 ng/ml, а CV по време на теста и интертеста е 7, 4 и 9, 6%.

Адипонектинът в серума се измерва, като се използва наличен в търговската мрежа комплект ELISA (Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA). Чувствителността е 0,5 ng/ml, а CV по време на теста и интертеста е 7,4 и 8,4%.

Серумен TNF-a се измерва, използвайки наличен в търговската мрежа комплект (Medical Systems) по метода на хемоилуминесценцията; чувствителност 1,7 pg/ml, CV в теста и в интерактивно изследване са 3, 6 и 6, 5%.

Hs-CRP се измерва по имунотурбидиметричен метод. Прагът на откриване е 0,5 mg/l. Референтният интервал е 3 mg/l. Аналитичната променливост е 5%.

Биопсии на мазнини и екстракция на иРНК

Биопсиите на мастната тъкан са взети сутрин след гладуване през нощта от подкожния корем (перибилибилно). Биопсиите се вземат с аспирационна игла. Мастната тъкан се измива старателно с изотоничен физиологичен разтвор и след това се замразява за по-късна екстракция на РНК.

PCR в реално време (RT-PCR) позволява количествено определяне на адипонектинова РНК, IkB-α и TNF-α. Накратко, общата РНК беше извлечена с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen, GMBH, Hilden, Германия) и обратна транскрипция с помощта на Syntax Syncesis Kit за IScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). RT-PCR се извършва с помощта на iCycler термоциклер (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), използвайки IQSYBR Green PCR SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и 300 pmol/ml от всяка двойка праймери. Условията за амплификация бяха както следва: 95 ° С за 5 минути, 50 цикъла при 95 ° С за 30 s, 60 ° C за 30 s и 72 ° C за 30 s. Грундовете са проектирани и оптимизирани за грундове, самозасмукване, пропускане на грундиране и дължина на ампликон, използвайки търговския софтуер Beacon Design 4.0 (Premier Biosoft International, Пало Алто, Калифорния, САЩ). Всички грундове са проектирани да имат подобно GC съдържание и се отгряват при същата температура от 60 ° C. Грундовете се доставят от MWG Biotech AG (Ebersberg, Германия). Резултатите се определят количествено като стойности на Ct, където Ct се определя като PCR прагов цикъл, при който амплифицираният продукт се открива за първи път, и се изразява като съотношение на целта към контрола (β-актин).

Статистически анализ

Резултатите се отчитат като средни ± sd Log трансформации са извършени за необичайни променливи. Корелацията на Пиърсън е използвана за тестване на връзката между променливите. Многократни регресионни анализи бяха използвани последователно и последователно за тестване на комбинираните ефекти на независими променливи върху експресията на адипонектин и IκB-α ген.

Поради големия брой тестове, извършени за корелационни анализи, беше прието значимо ниво P 20 за всички променливи

резултатът

Основните характеристики на изследваната проба са дадени в таблица 1.

Маса в пълен размер

Таблица 2 показва матричната корелация между антропометрични, FM% от DXA, метаболитни променливи, hs-CRP, серумни адипонектин, лептин, TNF-α и иРНК нива на адипонектин, TNF-α и IkB-α.

Маса в пълен размер

ИТМ и обиколката на талията са положително свързани с лептин, HOMA и hs-CRP и отрицателно с HDL-Ch. Паспортът също е отрицателно свързан с адипонектин и IkB-α иРНК. HOMA е отрицателно свързан с HDL-Ch, серумен адипонектин, адипонектин иРНК и положително свързан с лептин. Hs-CRP е отрицателно свързан със серумния HDL-Ch и IkB-α иРНК, докато е позитивно свързан с HOMA.

За да се определят комбинираните ефекти на ИТМ, обиколката на талията, триглицеридите, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, лептин, серум и TNF-α иРНК върху експресията на гена на адипонектин, беше извършен анализ на множествена регресия: бяха включени както лента, така и лептин. в най-подходящото уравнение за регресия за прогнозиране на експресията на гена на адипонектин (R2 = 0,43, P = 0,006) (Таблица 3).

Маса в пълен размер

Извършен е анализ на последователна множествена регресия, като IκB-α mRNA се счита за зависима променлива и всички свързани с IκB-α променливи в бивариантни анализи (BMI, обиколка на лентата, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP и mRNA на adiponectin) са независими променливи. MRNA на адипонектин беше единствената променлива, която влезе в регресия (R2 = 0, 406, P 4, 5, 6

Нашите констатации за отрицателната връзка между обиколката на талията и нивата на аРИПН адипонектин са в съответствие с предишни доклади, които показват, че експресията на гена на адипонектин е по-ниска при затлъстели лица с коремно затлъстяване, отколкото при пациенти с подкожно затлъстяване. 2, 4, 5, 21

Както се очакваше и в съответствие с предишни доклади 22 23, наблюдавахме значителна връзка между ИТМ, лента и инсулинова резистентност, както се оценява от HOMA, както и между ИТМ, лента и hs-CRP. 1, 24

Преди това се наблюдава силна връзка между възпалението и затлъстяването 1 и се съобщава за високи нива на hs-CRP при 35% от мъжете и 60% от жените с ИТМ над 30 kg/m2. По този начин, въпреки че много индивиди със затлъстяване показват повишени нива на hs-CRP, това не винаги е така. Предполага се, че появата на инсулинова резистентност може да е една от причините, поради които хората със затлъстяване показват високи нива на възпалителни маркери. 3 Отрицателната връзка между лентата и адипонектин иРНК, нивата на адипонектин иРНК и HOMA и положителната връзка между hs-CRP и HOMA може да означава, че адипонектинът може да бъде връзка между коремното затлъстяване, инсулиновата резистентност и възпалението. Ето защо е много важно да се изследват механизмите, които регулират експресията на гена на адипонектин. Когато извършихме последователен анализ на множествена регресия, използвайки BMI, лента, триглицериди, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, лептин, серумни нива на TNF-α и mRNA като независими променливи и експресия на гена на адипонектин като зависима променлива, само обиколка на лентата и лептин (с понижаващи и регулиращи ефекти) са включени в най-подходящото уравнение за регресия и представляват 40% от вариацията в експресията на гена на адипонектин. Инсулиновата резистентност, оценена от HOMA, е последната променлива, премахната от обратния модел при нашите пациенти.

Тези открития предполагат липса на независима връзка между инсулиновата резистентност, оценена от HOMA и експресията на гена на адипонектин, и изглежда противоречат на експериментите in vitro, проведени от Fasshauer et al., 25, които показват, че експресията на гена на адипонектин е понижена. За разлика от това, Lihn et al. 26 наблюдават, че нивата на адипонектин иРНК са положително корелирани с инсулиновата чувствителност при здрави индивиди, но не и при роднини на пациенти със захарен диабет тип 2, което предполага, че тази липса на регулация може да се дължи на състоянието на инсулинова резистентност при роднини тип 2 диабетици.

Нашите открития за независима връзка между лептина и адипонектиновата генна група за експресия са много интересни. Няколко in vitro проучвания не показват връзка между експресията на гена на лептин и адипонектин или наистина отрицателна корелация, 27, 28, но също така се предполага повишена регулация на експресията на гена на адипонектин от лептин. При нашите индивиди нивата на лептин са били значително свързани с HOMA и обиколката на талията, докато връзката между експресията на лептин и ген на адипонектин е настъпила едва след корекция за колана (r = 0,48, P = 0,016).

Нашите данни също така показват, че експресията на гена на адипонектин е положително свързана с IκB-α, за която е известно, че стимулира транскрипционната активност на NF-κB. При нашите индивиди, IkB-α mRNA е била отрицателно свързана с паспорта и hs-CRP и положително с експресията на гена на адипонектин. В последователния анализ на множествена регресия, използвайки IkB-α mRNA като зависима променлива, adiponectin mRNA беше единствената променлива, която влезе в регресия, обяснявайки 40% от дисперсията. Тези констатации допълват и разширяват предишни доклади. 7, 12 Всъщност по-рано е показано, че адипонектинът може да инхибира ендотелната NF-кВ сигнализация и че адипонектинът може да регулира възпалението на адипоцитите на свинете чрез частично инхибиране на транскрипционния фактор NF-кВ. 12 Наскоро се предполага, че активността на NF-κB адипоцитите може да играе важна роля в контрола на възпалението и метаболитните промени, свързани със затлъстяването. По този начин, значителната независима връзка между експресията на гена на адипонектин и IκB-α mRNA, наблюдавана при нашите индивиди, предполага, че когато експресията на гена на адипонектин е висока, има по-висока експресия на IκB-α и инхибиране на транскрипционната активност на NF-kB с по-ниско възпаление на нивата на адипоцитите.

Ограничения за проучване

Трябва да признаем някои от ограниченията на нашето проучване. Първо, тествахме IkB-α mRNA вместо активност. Нашите открития за ниска IkB-α mRNA при затлъстели индивиди трябва да се тълкуват с повишено внимание и да се потвърдят чрез оценка на активността на IκB-α и mRNA, както и мерки за активиране на NF-kB. Напоследък обаче, използването на RT-PCR за измерване на IκB-α mRNA се оказа ефективен метод за количествено определяне на транскрипционната сила на NF-kB. 29

Второ, оценихме инсулиновата резистентност, използвайки HOMA, добре приет заместител, полезен в клинични проучвания. Може обаче да се твърди, че ролята на инсулиновата резистентност в експресията на гена на адипонектин може да бъде по-подходяща, ако използваме по-сложни методи за оценка на инсулиновата чувствителност. Трето, нашите резултати от значителна връзка между адипонектин и IκB-α могат да покажат само връзка между променливи, а не причинно-следствена връзка. Следователно, нашата хипотеза за локален противовъзпалителен ефект на адипонектин чрез инхибиране на NF-κB активиране трябва да бъде потвърдена от допълнителни проучвания за оценка на причинно-следствената връзка.

В заключение, нашето проучване ясно показва, че обиколката на талията е положително свързана с инсулиновата резистентност и hs-CRP и отрицателно с адипонектиновата мРНК и IκB-α адипоцитите и по този начин с транскрипционния капацитет на NF-κB. Нашите открития освен това показват, че както коремното затлъстяване, така и лептинът са независими предиктори на експресията на гена на адипонектин; също предполагат, че в човешките адипоцити експресията на гена на адипонектин е силно свързана с IκB-α иРНК.