абстрактно
Мозъкът е силно обогатен с n-3 полиненаситена мастна киселина (PUFA), докозахексаенова киселина (22: 6n-3, DHA) и n-6 PUFA арахидонова киселина (20: 4n-6, AA). 1 при бозайници, DHA и AA се получават от диетата или се синтезират чрез десатурация/разширяване на съответните им диетични предшественици, α-линоленова киселина (18: 3n-3) и линолова киселина (18: 2n-6). 2 DHA и AA се естерифицират в sn-2 положението на мембранните фосфолипиди, където те играят роля в регулирането на мембранната течливост и при освобождаване от фосфолипаза А2 играят важна роля в мозъчната сигнализация, 3 невровъзпаление 4 и съответните им метаболити. 5 и биполярно разстройство. Балансираният състав на n-3 и n-6 PUFA мембраните във фосфолипидите е от решаващо значение за нормалната мозъчна функция. 8, 9
методи
Количествено определяне на DHA
Общите липиди бяха извлечени от фронталната кора по метода на Folch. Известно количество 1,2-дихептадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) беше добавено към част от тъканта като вътрешен стандарт преди екстракция. Метиловите естери на мастни киселини се образуват чрез нагряване на част от общите липидни екстракти в 1% H2S04 в метанол при 70 ° С в продължение на 3 часа. Метиловите естери бяха извлечени и разделени на капилярна колона с размери 30 х 0,25 mm (SP-2330, Supelco; Bellefonte, PA, USA), използвайки газова хроматография с пламъчен йонизационен детектор (модел 6890N, Agilent Technologies; Palo Alto, CA, CA). САЩ). Експериментите са започнати при 80 ° C, с температурен градиент до 160 ° C (10 ° C/min) и 230 ° C (3 ° C/min) за 31 минути и поддържани при 230 ° C в продължение на 10 минути. Пиковете бяха идентифицирани по време на задържане на стандартите за метилов естер на мастна киселина (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN, USA). Концентрациите на DHA в челната кора (μmol/g мокро тегло в мозъка) бяха изчислени чрез пропорционално сравняване на площта на пика на газова хроматография с площта на вътрешния стандарт на хептадекановата киселина (17: 0). 34
Приготвяне на цитозол
Цитоплазмени и ядрени екстракти се приготвят от фронталната кора, както е описано по-горе. Накратко, кората е хомогенизирана в 10 mM HEPES, рН 7,9, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM M EGTA, 1 mM DTT, 10 mM KCl, протеазен инхибиторен коктейл (Roche, Indianapolis, IN, USA). ) с помощта на тефлонов хомогенизатор за стъкло. След добавянето на 0,5% NP-40 бяха извършени още пет хода на хомогенизиране. Суспензията се инкубира за 10 минути върху лед и след това се центрофугира в микроцентрифуга при 13 000 g в продължение на 1 минута при 4 ° С. Супернатантът съдържа предимно цитоплазмени компоненти. Концентрациите на протеини на цитоплазмени и ядрени екстракти бяха определени с помощта на протеинов реагент Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Western blot анализ
Протеини от цитоплазмени и ядрени екстракти (75 μg) се разделят върху 10 до 20% SDS-полиакриламидни гелове (PAGE) (Bio-Rad). След SDS-PAGE протеините се прехвърлят електрофоретично в нитроцелулозна мембрана. Блокове от цитоплазмени протеини бяха инкубирани за една нощ в TBS буфер, съдържащ 5% неизсушено мляко на прах и 0,1% Tween-20, със специфични първични антитела (разреждане 1: 200) за група IVA cPLA2, група IIA sPLA2 и група VIA iPLA 2 36 ( Santa Cruz Biotech, Санта Круз, Калифорния, САЩ). Цитоплазмените протеинови блокове бяха инкубирани с подходящи HRP-конюгирани вторични антитела (Bio-Rad) и визуализирани чрез реакция на хемилуминесценция (Amersham, Piscataway, NJ, USA) върху рентгенов филм (XAR-5, Kodak). Оптичните плътности на имуноблот лентите бяха измерени с помощта на софтуера Alpha Innotech (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) и нормализирани до β-актин (Sigma), за да се коригира за неравномерно натоварване. Всички експерименти бяха проведени два пъти и стойностите бяха изразени като процент от контрола.
Изолиране на обща РНК и RT-PCR в реално време
Общата РНК беше изолирана от фронталната кора с помощта на RNeasy мини комплект за мозъчна и липидна тъкан (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). cDNA беше получена от обща РНК, използвайки комплект за архивиране на cDNA с висока производителност (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). нивата на cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 и COX-2 иРНК бяха измерени чрез количествена RT-PCR в реално време, използвайки система за откриване на последователността ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). Специфични праймери и сонди за cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 или COX-2 анализи на експресия на гени (Applied Biosystems) се състоят от 20x смес от немаркирани PCR праймери и сонда за свързване на Taqman с малък бразда (MGB). с етикет на багрило). Повтарящите се промени в генната експресия се определят с помощта на метода ACCT. 37 Данните са изразени като ниво на целевия ген (cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 или COX-2) при животни, лишени от n-3 PUFA, нормализирани към ендогенен контрол (β-глобулин) и спрямо нормализираното ниво в n- 3 PUFA (калибратор), както е описано по-горе. 30, 38 Всички експерименти бяха проведени два пъти в три екземпляра.
Дейности на фосфолипаза А 2
Статистически анализ
Данните са изразени като средно ± sem. Статистическата значимост е изчислена с помощта на двоен, несдвоен t-тест със стойността, зададена на P 10 15 седмици n-3 PUFA лишаване значително намалява (27%) концентрацията на DHA (12 ± 0,4 μmol/g мозък) на фронталната кора в сравнение с концентрацията v n-3. 3 плъха, съответстващи на PUFA (19 ± 0,5 μmol/g мозък) (P = 0, 0001).
лишаване от n-3 PUFA намалява активността на iPLA2, протеини и иРНК
Петнадесет седмици на лишаване от n-3 PUFA при плъхове значително намаляват активността на iPLA 2 фронталната кора (21%) (Фигура 1а) в сравнение с плъхове, съответстващи на n-3 PUFA. Това намаление е придружено от 27% намаление на iPLA2 протеина (Фигура 1b) и 50% намаляване на iPLA2 mRNA в сравнение с плъхове, съответстващи на n-3 PUFA (Фигура 1в).
Дейности по IPLA2 ( а ), нива на протеин б ) и нивата на иРНК ( ° С ) във фронталната кора на n-3 PUFA адекватно и без плъхове. IPLA2 активност при n-3 PUFA адекватна (n = 10) и n-3 PUFA лишени (n = 8) плъхове (* P = 0,010) ( а ). Представителни нива на имуноблоти и iPLA2 протеин в n-3 PUFA адекватни (n = 10) и n-3 PUFA-лишени (n = 10) плъхове (* P = 0.024) ( б ). Нива на иРНК на IPLA2 в n-3 PUFA адекватни (n = 5) и n-3 PUFA лишени (n = 6) плъхове (* P = 0.021) ( ° С ). Данните бяха сравнени с помощта на несдвоени тестове, средно ± sem
Изображение в пълен размер
лишаването от n-3 PUFA повишава активността на cPLA2 и sPLA2, протеин и иРНК
Активността на CPLA2 беше значително увеличена (83%) във фронталната кора на плъховете на плъхове n-3 PUFA в сравнение с плъхове, съответстващи на n-3 PUFA (Фигура 2а). Това увеличение беше придружено от значително увеличение на протеина (22%) (Фигура 2b) и експресията на mPNA на cPLA2 (4-кратно) (Фигура 2c) в сравнение с плъхове, подходящи за n-3 PUFA. Подобно на cPLA2, 15 седмици на лишаване от n-3 PUFA значително повишават активността на sPLA2 (25%) (фигура 2г), протеина (36%) (фигура 2д) и експресията на иРНК (4.6 пъти) (фигура 2е) в сравнение с n- 3 PUFA адекватни плъхове.
cPLA2 активност ( а ), нива на протеин б ), нива на иРНК ( ° С ) и sPLA2 дейности ( д ), нива на протеин д ) и нивата на иРНК ( е ) във фронталната кора на n-3 PUFA адекватно и n-3 PUFA лишени от плъхове. cPLA2 активност при n-3 PUFA адекватна (n = 10) и n-3 PUFA лишени (n = 8) плъхове (* P = 0.022) ( а ). Представителни имуноблоти и нива на cPLA2 протеин на n-3 PUFA адекватни (n = 10) и n-3 PUFA лишени (n = 10) плъхове (* P = 0,010) ( б ). нива на cPLA2 иРНК на n-3 PUFA адекватно (n = 6) и n-3 PUFA лишени (n = 6) плъхове (*** P = 0, 0001) ( ° С ). sPLA2 активност при n-3 PUFA адекватна (n = 10) и n-3 PUFA лишени (n = 8) плъхове (* P = 0, 040) ( д ). Представителни имуноблоти и нива на sPLA2 протеин на адекватни n-3 PUFA (n = 10) и плъхове, лишени от n-3 PUFA (n = 10) (* P = 0, 020) ( д ). Нива на mRNA на SPLA2 в n-3 PUFA адекватни (n = 6) и n-3 PUFA лишени (n = 6) плъхове (*** P = 0, 00012) ( е ). Данните бяха сравнени с помощта на несдвоени тестове, средно ± sem
Изображение в пълен размер
Лишаването от n-3 PUFA намалява нивата на COX-1 протеин и повишава нивата на COX-2 протеин и тРНК
Петнадесет седмици на лишаване от n-3 PUFA значително намаляват COX-1 протеина (28%), без да променят нивото му на иРНК (Фигура 3а и b). Нивата на COX-2 протеин (38%) и mRNA (2,4 пъти) са значително по-високи във фронталната кора на плъхове, които се хранят с диета, лишена от n-3 PUFA, в сравнение с тези, които ядат адекватна диета с n-3 PUFA (Фигура 3в реклама).
COX-1 протеин ( а ) и нивата на иРНК ( б ), COX-2 протеин ( ° С ) и нивата на иРНК ( д ) във фронталната кора на адекватни плъхове, лишени от n-3 PUFA и n-3 PUFA. Представителни нива на имуноблоти и COX-1 протеин в n-3 PUFA адекватни (n = 10) и n-3 PUFA (n = 10) лишени от плъхове (* P = 0.03) ( а ). Нива на COX-1 иРНК в n-3 PUFA адекватни (n = 6) и n-3 PUFA лишени (n = 6) плъхове (P> 0.05) ( б ). Представителни нива на имуноблоти и COX-2 протеин в n-3 PUFA адекватни (n = 10) и п-3 лишени (n = 10) плъхове (* P = 0.002) ( ° С ). Нива на COX-2 иРНК при плъхове, адекватни на n-3 PUFA (n = 6) и n-3 PUFA лишени (n = 6) плъхове (* P = 0.033) ( д ). Данните бяха сравнени с помощта на несдвоени тестове, средно ± sem
Изображение в пълен размер
дискусия
Освобождаването на DHA от мембранния фосфолипид се регулира предимно от iPLA2 11, 40 (Фигура 4). Увеличеният полуживот на DHA в мозъка на плъхове, лишени от n-3 PUFA 10, вероятно се дължи на намалена активност на iPLA2, както се наблюдава в това проучване. Функционалната връзка между iPLA 2 и COX-1 приключва. Когато различни PLA2 и COX бяха трансфектирани в комбинация в 293 човешки ембрионални бъбречни клетки, iPLA2 не успя да се свърже с COX-2, измерено чрез забавения PG биосинтетичен отговор, но в двойка с COX-1. Намалената експресия на протеин iPLA2 при плъхове, лишени от n-3 PUFA, съответства на намалена експресия на COX-1 протеин. Въпреки това, няма значителна промяна в COX-1 иРНК в n-3 PUFA иРНК на плъх. Това предполага, че промените в COX-1 са медиирани след транскрипция.
Схематично представяне на взаимодействия в каскади AA и DHA. Мембранните фосфолипиди се хидролизират с cPLA2 или sPLA2, които освобождават n-6 PUFA, AA и лизофосфолипид. iPLA2 катализира освобождаването на n-3 PUFA, DHA и лизофосфолипид. Част АА се превръща в ейкозаноиди чрез COX-1 или 2 и освободената DHA може да инхибира експресията на COX-2 иРНК или може да бъде катализирана от COX-2 или липоксигеназа (LOX), за да се получи 13-OH-DHA 60 или други биоактивни агенти. метаболити. В нашето проучване 15 седмици n-3 PUFA намаляват лишаването от DHA на мозъка и експресията на iPLA2, като същевременно увеличават експресията на cPLA2, sPLA2 и COX-2. Вижте рецензията за повече подробности. 3, 61 * Този процес може да се осъществи чрез метаболита DHA. PL = фосфолипид.
Изображение в пълен размер
Няколко проучвания показват кръстосана дискусия между cPLA 2 и sPLA 2. cPLA2 регулира sPLA2-зависимото производство на AA и PGE2 в индуцирани от липополизахариди активирани макрофаги 17 и в sPLA2-дефицитни остеобластни клетки. 47 cPLA2 регулира експресията и функцията на sPLA2 във фибробластните клетки. 16 cPLA2 инхибитори блокират sPLA2-медиирано освобождаване на АА в макрофаги 48, а данните, получени от мезангиални и човешки астроцитомни клетки на плъхове, показват, че sPLA2 може да активира cPLA2 чрез PKC/Raf-1/MAPK сигнален път. 18, 19 В настоящото проучване лишаването от DHA в мозъка значително повишава активността на cPLA2 и sPLA2, протеини и иРНК. Тъй като PLA2 регулира освобождаването/рециклирането на АА от фосфолипидите, повишеното cPLA2 и/или sPLA2 може да обясни увеличения мозъчен арахидоноил-CoA, наблюдаван след 15 седмици на лишаване от n-3 PUFA. 10 Допълнителни проучвания, изследващи кинетиката на АА при плъхове, лишени от n-3 PUFA, са оправдани, за да се провери дали метаболизмът на АА се увеличава.
Диета с ниско съдържание на n-3 PUFA е свързана с повишен риск от биполярно разстройство 49, а добавките с n-3 PUFA подобряват някои от симптомите на биполярно разстройство. Терапевтично еквивалентни нива на антиманиакални агенти (литий, карбамазепин и валпроат) намаляват оборота на АА, но не и на DHA във фосфолипиди на плъхове. 34, 50, 51, 52, 53 Способността на лития и карбамазепина да го правят се дължи на способността им да намаляват транскрипцията на cPLA2 и активността в мозъка на плъхове, 34, 38, 50, 54, докато валпроатът вероятно е насочен към дълговерижни ацил- CoA. синтетази. И трите лекарства намаляват активността на COX-2 и мозъка PGE2 при плъхове. 38, 50, 56, 57 Петнадесет седмици лишаване от n-3 PUFA увеличава степента на депресия и агресия при плъхове, поведения, за които се смята, че съответстват на биполярно разстройство при хората. Повишените нива на cPLA2 и COX-2 в плъхове, лишени от n-3 PUFA в настоящото проучване, са в противоречие с това, което е съобщено за антимицитни лекарства и подкрепят хипотезата, че тези ензими са мишени на тези лекарства. В допълнение, индуцирането на невровъзпаление при гризачи увеличава експресията на cPLA2, sPLA2 и COX-2 в мозъка. 5, 58 Повишените нива на DHA в мозъка чрез допълване с n-3 PUFA в диетата могат да нормализират променената АА сигнализация при биполярно разстройство и невро-възпаление.
И накрая, 15 седмици на лишаване от n-3 PUFA намалява експресията и активността на iPLA2 и COX-1, като същевременно увеличава активността и експресията на cPLA2, sPLA2 и COX-2 в кората на плъх на плъх. Намаляването на iPLA 2 може да послужи за намаляване на метаболитната загуба на DHA в мозъка, като по този начин удължава неговия полуживот. Промените в cPLA2 и COX-2 са противоположни на тези, публикувани след прилагане на антиманиакалния агент на плъхове, което предполага, че плъховете, лишени от n-3 PUFA, могат да бъдат по-податливи на възпаление и други мозъчни обиди.