цикличният

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Екзогенният сАМР подобрява фенотипа, свързан със стареенето при по-възрастни мишки
  • cAMP имитира ефектите от ограничаването на калориите, като увеличава нивата на сиртуин
  • CAMP лечението подобрява метаболизма на мазнините, за да намали имитиращите калории
  • cAMP разпространява сиртуин, за да предотврати окислително увреждане и стареене на клетките
  • cAMP директно свързва SIRT1 и SIRT3
  • дискусия
  • Експериментални процедури
  • Животни и диети
  • Клетъчна култура и лечение
  • Поведенчески тестове
  • Измерване на съдържанието на карбонил 8
  • Измерване на нуклеотиди
  • Биохимични измервания
  • Наблюдение на хистохимични срезове
  • Анализ на протеини
  • Повърхностен плазмен резонанс
  • Статистически анализи
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

абстрактно

Цикличният аденозин монофосфат (сАМР) играе важна роля в много биологични процеси като втори пратеник и се съобщава, че лечението с сАМР удължава живота на див тип Drosophila melanogaster. Нашето проучване показа, че екзогенният сАМР подобрява свързаните със стареенето фенотипове чрез повишаване нивото на сиртуини, което предотвратява метаболитните нарушения да имитират ефекта на калориите. Експериментите in vitro показват, че сАМР се свързва директно с SIRT1 и SIRT3 и впоследствие увеличава тяхната активност. Тези открития предполагат, че сАМР забавя процеса на стареене и е добър кандидат за имитиране на ограничаване на калориите. Нашите изследвания предоставят обещаваща терапевтична стратегия за заболявания, свързани със стареенето, причинени от метаболитно разстройство.

Ограничаването на калориите е ефективна интервенция за удължаване както на средния, така и на максималния живот 1. Ефектът против стареене на приема на калории обаче изисква намаляване на приема на калории с около 30 до 40%, което е непоносимо за повечето хора. Много изследователи са се опитали да намерят лекарство, което имитира ограничаване на калориите, което има антиейдж ефект, без да намалява енергийния прием, като ресвератрол 2. Неотдавнашно проучване съобщи, че ресвератролът има анти-стареещи ефекти чрез инхибиране на сАМР хидролизата. Ролипрам, който по-специално инхибира хидролизата на сАМР, имаше подобни ефекти като ресвератрола 3, което предполага потенциала на сАМР като миметик с ограничен калоричен потенциал. Друго проучване показа, че продължителността на живота на див тип Drosophila melanogaster след лечение с cAMP 4 е значително увеличена, което предполага, че cAMP може да играе ключова роля за забавяне на процеса на стареене на организмите.

SIRT1 е предложен като протеин против стареене и неговото активиране води до положителни ползи за здравето на няколко организма 5. Съобщава се, че липсата на CAMP обвързване с отзивчиви елементи (CREB) намалява експресията на SIRT1; CREB директно регулира транскрипцията на Sirt1 в невронни клетки чрез свързване към Sirt1 хроматин 6. Неотдавнашно проучване показа, че cAMP активира калмодулин киназа киназа II (CaMKKII), за да увеличи нивото на фосфорилиране на AMPK, като по този начин насърчава производството на NAD + и активирането на SIRT1 3. Друго проучване показва, че активирането на cAMP-PKA сигналния път води до бързо фосфорилиране на SIRT1, без да променя нивото на NAD + 7. Тези открития подчертават връзката между сАМР и SIRT1 по различни пътища и предполагат, че сАМР може да бъде специфичен активатор на SIRT1 и да имитира анти-стареещия ефект на ограничаването на калориите.

SIRT3, като хомоложна деацетилаза на SIRT1, се намира главно в митохондриите, където намалява количеството реактивни кислородни форми (ROS), отговорни за индуцирането на клетъчното стареене 8, 9. Освен това има независима система за регулиране на производството и разграждането на сАМР в митохондриите, за да се контролира генерирането на ROS 10, 11, но дали сАМР може да регулира SIRT3 за намаляване на оксидативния стрес, не е съобщено.

cAMP изпълнява различни метаболитни процеси, свързани с хормоналния метаболизъм като втори посланик, а реакцията на cAMP за много хормони намалява със стареенето 12, което предполага, че cAMP трябва да играе важна роля в регулирането на процеса на стареене. Нашето проучване показа, че прилагането на екзогенен сАМР (дибутирил цикличен аденозин, db-сАМР) повишава нивата на сиртуин протеин, за да имитира анти-стареещите ефекти на ограничаването на калориите, включително предотвратяване на метаболитни нарушения и подобряване на свързаните с възрастта фенотипове. Резултатите показаха, че сАМР може да се комбинира директно със SIRT1/SIRT3, което предполага, че сАМР има антиейдж ефект и е добър кандидат за миметици с ограничена калория.

резултатът

Екзогенният сАМР подобрява фенотипа, свързан със стареенето при по-възрастни мишки

CAMP лечението подобрява метаболизма на мазнините, за да намали имитиращите калории

За да демонстрираме ролята на сАМР в намаляването на калориите, хранехме мишки с диета с високо съдържание на мазнини (60% енергия от мазнини), съдържаща различни дози сАМР или ресвератрол като положителен контрол. Резултатите показаха, че телесното тегло на лекуваните сАМР мишки показва дозозависимо намаляване в сравнение с нетретираните мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (фиг. 2А), без значителни промени в приема на храна (фиг. 2Б). Диетата с високо съдържание на мазнини доведе до координиран функционален спад, причинен от наднорменото тегло; CAMP лечението подобрява двигателната координация при мишки с високо съдържание на мазнини (Фиг. 2C). Ние анализирахме епидидималната мастна тъкан на мишки и установихме, че лечението с цАМФ причинява дозозависимо намаляване на размера на мастната тъкан (фиг. 2D). Резултатите от биопсията показват, че диетата с високо съдържание на мазнини води до увеличаване на размера на адипоцитите в мишкия черен дроб и мастната тъкан на корема; след сАМР лечение, размерът на адипоцитите има тенденция да се нормализира (Фиг. 2Е, F). Нивата на триглицеридите и общия холестерол бяха повишени в групата с високо съдържание на мазнини в сравнение с нетретираната група, а групата, лекувана с сАМР, имаше по-ниски нива и на двете, което предполага, че сАМР може да подобри метаболитните нарушения (Фиг. 2G, H).

cAMP разпространява сиртуин, за да предотврати окислително увреждане и стареене на клетките

Намалената клетъчна пролиферация и повишеният оксидативен стрес са две важни причини за стареенето на клетките. За да изследваме механизма, залегнал в основата на антиейдж ефекта на сАМР, ние изследвахме промени в клетъчния цикъл със или без лечение с сАМР в сравнение с Rolipram като положителна контрола. Резултатите показаха, че делът на S-фазовите клетки показва нарастваща тенденция, но не достига статистическа значимост, което предполага, че механизмът на анти-стареене сАМР не зависи от увеличената клетъчна пролиферация (Фиг. 3А).

За да потвърдим активиращия ефект на сАМР върху сиртуин, измерихме вътреклетъчни нива на сАМР и резултатите от диференциацията в клетъчната линия C2C12 (фиг. 3F, G), тъй като ограничаването на глюкозата инхибира диференциацията на скелетните миобласти чрез активиране на SIRT122. Резултатите показаха, че лечението с цАМР инхибира диференциацията на клетките С2С12, което предполага, че сАМР увеличава активността на SIRT1. Въз основа на резултатите от нашите експерименти с животни, ние предположихме, че анти-стареещият ефект на сАМР може да бъде постигнат чрез намаляване на оксидативния стрес, така че използвахме водороден прекис (генериран от ROS), за да индуцираме клетъчното стареене. Резултатите от свързаната със стареенето β-галактозидаза (SA-β-gal) показват, че лечението с cAMP може да предотврати ROS-индуцирано стареене на клетките (Фиг. 3Н), което предполага, че cAMP намалява оксидативния стрес. Резултатите също така показаха, че лечението с db-cAMP е загубило функцията си при намаляване на броя на положителните оцветяващи клетки с лечение с EX-527 (инхибитор на сиртуин), което предполага, че способността на cAMP оксидативен стрес зависи от сиртуин (Фигура S). Тези резултати предполагат, че антиоксидантният ефект на сАМР трябва да зависи от повишаване на активността както на SIRT1, така и на SIRT3.

cAMP директно свързва SIRT1 и SIRT3

За по-нататъшно изследване на механизма на регулаторния ефект на сАМР върху сиртуин, извършихме in vitro анализ на активността на сиртуин. Резултатите предполагат, че сАМР може да увеличи активността на SIRT1 и SIRT3 (Фиг. 4А, В). Освен това се използва техниката на повърхностния плазмонен резонанс (SPR) за откриване на взаимодействието между сАМР и сиртуин. Резултатите показаха, че cAMP може да се свързва директно с SIRT1 (KD = 1,05) и SIRT3 (KD = 4,708) in vitro (Фиг. 4C-E). Тъй като и SIRT1, и SIRT3 са зависими от NAD + лизин деацетилази и NAD + съдържа AMP част, структурното сходство на cAMP с NAD + води до подобна способност за свързване. Извършен е анализ на автотранспорт, за да се обясни механизмът, лежащ в основата на резултата от свързването на сАМР към SIRT1, и местата на свързване на сАМР са показали, че са подобни на NAD +, когато са свързани с протеин SIRT1 (Фиг. 4F, G). Нашата работа може да осигури отправна точка за изучаване на основния механизъм на регулаторния ефект на cAMP върху сиртуин (фиг. 5).

( A ) Анализ на активността на SIRT1. ( Б. ) Анализ на активността на SIRT3. ( C - E ) Повърхностен плазмонен резонанс, измерващ свързването на cAMP или db-cAMP с протеини SIRT1 или SIRT3. Протеините SIRT1 или SIRT3 бяха имобилизирани върху сензорен чип CM5. Анализите на свързване се извършват, като се използва диапазон от концентрации на cAMP или db-cAMP (15, 6-500 μM). ( F, G ) Механична диаграма на взаимодействието между cAMP и SIRT1, получена чрез доков анализ. Първата графика показва взаимодействието между NAD и SIRT1 в сравнение с втората графика, която показва взаимодействието между cAMP и SIRT1. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на еднопосочен ANOVA. # p ## p ### p

Изображение в пълен размер

дискусия

Нашето проучване показва, че хранителните добавки сАМР могат да увеличат регулирането на нивата на сиртуин протеин, като по този начин забавят появата на свързаните с възрастта фенотипове чрез предотвратяване на метаболитни нарушения. Ние показахме, че сАМР може да се свързва директно с SIRT1 и SIRT3 in vitro, като по този начин увеличава дейностите на SIRT1 и SIRT3 и имитира ефектите от ограничаването на калориите. Тези открития показват, че сАМР играе важна роля в процеса на стареене и има обещаващ потенциал като миметик с ограничен калории за превенция на заболявания, свързани със стареенето.

След откриването на cAMP като втория пратеник, довел до Нобеловата награда на изследователя през 1971 г., проучванията се фокусират върху cAMP. Към днешна дата обаче cAMP не се е появил като кандидат за имитиране на ограничаване на калориите, за да забави процеса на стареене. Проучванията показват, че гладуването увеличава нивата на сАМР в резултат на високи нива на глюкагон или ниски нива на инсулин/IGF-1, сигнализиране 15, 23, което предполага, че сАМР може да играе важна роля в ограничаването на калориите. Въпреки това, преди нашето проучване, екзогенният сАМР не се съобщава като кандидат за имитиране на ограничаване на калориите. Нашата работа предоставя доказателства в подкрепа на това, че ограничаването на калориите повишава ендогенните нива на цАМФ в множество органи, за да подобри фенотипите, свързани със стареенето. Освен това екзогенният сАМР може да имитира анти-стареещия ефект на ограничаването на калориите, включително регулиране на SIRT1 и SIRT3, които са ключови протеини в метаболизма и стареенето.

Физиологичната вътреклетъчна концентрация на сАМР е 0,1 - 1 μM, но в случай на хормони или стрес концентрацията на cAMP може да се увеличи повече от стократно (приблизително 100 μM). При нашата оценка на SIRT1 и SIRT3 активности, ние използвахме 100 μM cAMP и db-cAMP, за да имитираме концентрации във физиологичния диапазон. Тъй като само част от добавения сАМР може да влезе стабилно в клетките, ние предполагаме, че тези концентрации могат да имат подобен ефект като леки условия на стрес, т.е. ограничаване на калориите.

Напоследък се съобщава, че ресвератролът е инхибитор на фосфодиестеразата (PDE4), който конкурентно се свързва с PDE4 и инхибира разграждането на cAMP 3. Ние предположихме, че сАМР може да се свърже със SIRT1, а резултатите от SPR доказаха нашата хипотеза и демонстрираха, че сАМР и SIRT1 имат пряко взаимодействие in vitro. По-интересното е, че cAMP също има директно взаимодействие със SIRT3, който регулира производството на ROS на митохондриите и забавя процеса на стареене. И SIRT1, и SIRT3 са зависими от NAD + лизин деацетилази. NAD + съдържа AMP част, така че cAMP директно взаимодейства със семейството на протеините Sirtuin. Нашата работа предостави доказателства, че сАМР може да бъде субстратен аналог на сиртуин при условия с ограничена калория.

Резултатите от автоматичното докинг показаха, че cAMP взаимодейства с джоба за свързване NAD + SIRT1, но не блокира каталитичния сайт. Реакцията на сиртуин и NAD + доведе до хидролизата на NAD + на две части, NAM и 2'-О-ацетил-ADP-рибоза. Въз основа на анализа на молекулярната структура на сАМР и NAD +, можем да забележим, че когато сАМР се свързва със SIRT1, само половината от свързващата торба е заета и е налична каталитична страна за реакцията между SIRT1 и NAD +. В този случай NAD + ще взаимодейства с каталитичния център, което води до по-висок риск от NAD + хидролиза. Ние предположихме, че свързването на cAMP със сиртуин намалява стабилността на NAD +, което подобрява ефективността на реакцията между NAD + и сиртуин.

Ние предположихме, че свързването на cAMP и SIRT1 защитава каталитичното място, което беше свързващият джоб на Sirtuin и NAD +. По този начин, сАМР може да повиши пост-транскрипционно нивото на SIRT1 протеин, както вече обсъдихме. Предполагаме, че ефектът на сАМР върху увеличаване на нивата на протеини SIRT1 и SIRT3 се основава на повишаване на тяхната протеинова стабилност чрез свързване, което може да ограничи разграждането на протеина.

Нашата работа показа, че cAMP е добър кандидат за имитиране на ограничаване на калориите. Като вътреклетъчен втори пратеник, сАМР е важен в много биологични процеси. Процесът на стареене също е сложен и не може да бъде обяснен с един-единствен сигнален път. Ние вярваме, че ефектът против стареене на cAMP може да зависи от мрежа за предаване на сигнали, която включва повече от една цел, което означава, че cAMP е насочена към множество сигнални каскади при регулирането на процеса на стареене.

Експериментални процедури

Животни и диети

Млади (3-месечни) мъжки мишки BALB/c са закупени от лаборатории Vital River и са третирани в съответствие с инструкциите и одобрението на Китайската институционална комисия по етика. Допълнителни подробности са дадени в допълнителния материал.

Клетъчна култура и лечение

Клетъчните линии C2C12 и 3T3-L1 се култивират в DMEM (Thermo Scientific), допълнена с 10% FBS в 5% CO 2. Пример 527, съединение С, STO609 (Sigma) и H89 (клетъчна сигнална технология) бяха добавени 1 час преди администриране на цикличен AMP, db-cAMP и Rolipram (Enzo Life Sciences). След това клетките бяха инкубирани за още 1 час преди прибиране на реколтата. Допълнителни подробности са дадени в допълнителния материал.

Поведенчески тестове

За всяка група се измерва локалната двигателна активност и времето, изминало от ускоряващия въртящ се прът (Китайска академия на медицинските науки), за да се тества координацията и баланса на двигателя. Водният лабиринт на Морис и латентността на падането от струнните тестове бяха извършени с помощта на оборудване от Центъра за наука за живота в университета Цингхуа.

Измерване на съдържанието на карбонил 8

Количествено белтъчните карбонили се определят с 2,4-динитрофенилхидразин (DNPH). Накратко, 1 ml от 0,5 mg протеин се третира с 200 ml от 10 mM DNPH (разтворен в 2М НС1) в продължение на 1 час и след това се утаява с 10% трихлороцетна киселина. Пелетите се измиват три пъти с 1: 1 (v/v) етанол: етилацетат и се разтварят в 0,5 ml 0,2% SDS, 20 mM Tris-Cl, рН 6, 8. След това се определя концентрацията на протеин в крайния разтвор с помощта на BCA комплект (Thermo Scientific) и се измерва абсорбцията при 360 nm, за да се изчисли съдържанието на карбонил. Като заготовки бяха използвани протеинови проби, третирани с HCl, но не DNPH.

Измерване на нуклеотиди

Измерването на cAMP се извършва в съответствие с инструкциите на производителя, като се използва Glo-cAMP комплект за анализ (Promega). Допълнителни подробности са дадени в допълнителния материал.

Биохимични измервания

Измерването на общия холестерол, триглицеридите и MDA се извършва в съответствие с инструкциите на производителя, като се използва комплект за количествено определяне (Blue Gene). SA-ß-gal оцветяването е извършено в съответствие с инструкциите на производителя (Sigma).

Наблюдение на хистохимични срезове

Секции на черния дроб и мастната тъкан се оцветяват с хематоксилин и еозин; кожният колаген се оцветява с трихрома на Masson. Наблюденията бяха извършени с помощта на светлинен микроскоп (Leica) и сканирани при 40-кратно увеличение.

Анализ на протеини

Пробите за Western blot бяха пуснати върху 10% SDS-полиакриламидни гелове и прехвърлени в PVDF мембрани. Използвани са следните антитела: SIRT1, SIRT3 NF-κB и PPARγ (клетъчна сигнална технология) и CaMKKII, PKAc, SIRT6 (Abgent) и PEPCK и актин (Санта Круз).

Повърхностен плазмен резонанс

Пречистените SIRT1 (Abcam, чистота = 95%) или SIRT3 (R&D, чистота = 95%) протеини бяха имобилизирани върху CM5 сензорен чип (T200 Biacore, GE). Резултатите от рН сортиране и обездвижване са дадени в допълнителната информация (Фигура S3-4).

Статистически анализи

Сравненията между групите бяха извършени чрез еднопосочна ANOVA. Разликите се считат за статистически значими при p