елементи

абстрактно

Основното

През последните години се доказа, че рецепторът за фарнезоид X (FXR, известен също като NR1H4), ядрено-рецепторен сензор за жлъчна киселина, играе ключова роля в поддържането на хомеостазата на жлъчните киселини. 2, 3, 4 FXR участва в контрола на синтеза на жлъчна киселина в черния дроб и транспорта на жлъчна киселина чрез ентерохепатална циркулация. Този ядрен рецептор се експресира в черния дроб и червата, както и в други органи и тъкани, като надбъбречните жлези и мастната тъкан. 5, 6 След активирането си, чернодробният FXR потиска синтеза на жлъчна киселина чрез транскрипционно понижаване на регулирането на ензима Cyp7A1, 7, 8, който катализира първите и контролиращи скоростта стъпки в първичната каскада на синтеза на жлъчна киселина. Предишно проучване от нашата лаборатория показа, че FXR-нулевите мишки показват, както се очаква, повишени нива на експресия на ген cyp7A1 в черния дроб. Освен това е показано, че тези мишки имат повишена скорост на синтез на холева киселина и увеличен размер на пула на холевата киселина. 3

Въпреки това, в допълнение към инхибиторните ефекти на активирания чернодробен FXR, Cyp7A1 се регулира от няколко други FXR-зависими и независими механизма. Няколко CLOCK-зависими транскрипционни фактора участват в поддържането на циркадната експресия на Cyp7A1, т.е. Dbp, Rev-erb и E4BP4. 9, 10, 11 В допълнение, FXR-медииран метод за контролиране на чернодробната експресия на Cyp7A1, медииран от индиректна тънкочревна сигнализация, представлява интерес. Индуцирано от жлъчната киселина активиране на чревния FXR индуцира експресията на миши фибробластен растежен фактор 15 (Fgf15) 12 и неговия човешки ортолог FGF19. За разлика от повечето други Fgf протеини, Fgf15/19 има слаб афинитет на свързване към хепарин, което му позволява да избегне предварително улавяне в извънклетъчните матрици. В резултат Fgf15, получен от червата, е в състояние да достигне до черния дроб и да действа като ендокринен фактор. При активиране на неговия чернодробен рецептор, изотипът 4 Fgf рецептор (FGFR4), който изисква p-Klotho като ко-рецептор за оптимална функционалност, се потиска от експресията на Cyp7A1. 14, 15

Kim et al. 16 наскоро сравнява метаболизма на жлъчните киселини при чернодробни и чревно специфични FXR нокаутиращи мишки, за да изследва относителния принос на чернодробните и чревните FXR в контрола на синтеза на жлъчна киселина. Заключенията на Kim et al 16 се основават на само относително малки разлики в нивото на генна експресия. В това проучване ние разглеждаме относителния принос на пътя FXR-Fgf15 за синтеза на чернодробна жлъчна киселина не само чрез изследване на промените в нивата на генна експресия, но по-важното, чрез определяне на ефекта от чревната селективна делеция на FXR върху физиологичните параметри. като образуването на жлъчка и кинетиката на ентерохепаталната циркулация на жлъчните киселини. В допълнение, относителният принос на чревния сигнален път FXR-Fgf15 се определя по време на модулацията на доставката на жлъчна киселина чрез подаване на жлъчна киселина и секвестиране на жлъчна киселина. Fgf15 допринася за регулирането на синтеза на жлъчна киселина при мишки главно по време на тъмната фаза. Разширяването на запасите от циркулираща жлъчна киселина и секвестирането на жлъчните киселини намаляват ролята на чревната сигнализация на FXR-Fgf15 в контрола на синтеза на жлъчна киселина и производството на жлъчна киселина.

РЕЗУЛТАТИТЕ

Характеристики на чревна селективна чревна селективна Fxr нокаут мишка

Профилите на експресия на иРНК на Fxr и Fgf15 по тънките черва бяха анализирани чрез RT-PCR. Както е показано на Фигура 1, експресията на Fxr иРНК се очаква да бъде най-висока в дисталното тънко черво на WT мишки. Fgf15 се експресира главно в дисталния илеум на WT мишки, но неговият модел на експресия не съвпада напълно с експресията на Fxr. IFXR-KO мишките показаха практически пълно отсъствие на Fxr и силно намаляване (средно намаление: 82%) в експресията на Fgf15 по червата. Целите на FXR бяха анализирани в три инстистинални сегмента (проксимален, среден и дистален) и беше установено, че се експресират при по-ниски нива в тънките черва на iFXR-KO мишки, т.е. експресията на Ibabp и Ost-α се увеличава към дисталната посока и терминален илеум е намален с 87 и 49% при iFXR-KO мишки (данните не са показани). Илеалната експресия на Asbt, за която е известно, че не се регулира от FXR при мишки, 4 се увеличава в дисталната посока, без да показва разлики между двете групи. Показано е, че Shp, важен FXR целеви ген в черния дроб, се експресира предимно в проксималната част на тънките черва и в двете групи и не може да бъде открита разлика между iFXR-KO и контролните мишки.

чревното

Относителна структура на генната експресия по тънките черва. Тънкото черво на мъжки мишки от див тип (WT) (отворени кръгове, п = 3) и мъжки чревни селективни FXR нокаут мишки (плътни кръгове, п = 3) се промиват с PBS и се изрязват шест сегмента; 0, 33, 66, 83, 90 и 100% (относително разстояние от стомаха до дисталния илеум). Относителните нива на експресия на гените Fxr и Fgf15 в сравнение с 18S бяха анализирани чрез RT-PCR. Стойностите се изразяват като средна стойност ± sd

Изображение в пълен размер

На 3-месечна възраст телесното и чернодробното тегло на iFXR-KO мишките е значително по-ниско от това на WT котилите (Таблица 1), но съотношенията между черния дроб и телесното тегло не се различават между групите. Наблюдаваните разлики в телесното тегло и чернодробното тегло са последователни, т.е. те се наблюдават във всички възрастови категории от 4 до 28 седмици и остават след хранене със специфични диети (данните не са показани и допълнителна таблица S2). Освен относително лекото увеличение на TCA-индуцираното, не се наблюдават разлики в плазмените AST и ALT активности между iFXR-KO и контролни мишки (Таблица 1 и Допълнителна таблица S2). Освен това не са наблюдавани разлики в морфологията на черния дроб между групите (Фигура 2). Таблица 1 освен това показва, че намаленото телесно тегло при iFXR-KO мишки не се дължи на намален прием на храна. Мишките с дефицит на FXR в цялото тяло показват повишени плазмени нива на липидите, 3, 4 с високи плазмени нива на холестерол и триглицериди. За разлика от това не открихме значителни разлики в плазменото или чернодробното съдържание на липиди между WT и iFXR-KO мишки, хранени с диета (Таблица 1).

Маса в пълен размер

Чернодробна морфология на фураж, обогатена с 0,5% TCA или 2% обогатена с Colesevelam HCl диета, хранена с WT и чревни селективни FXR нокаут мишки. Хистологичното изследване на морфологията на черния дроб се оценява чрез оцветяване с хематоксилин/еозин (вж. „Материали и методи“). Чернодробната морфология на WT и подбрани от червата FXR нокаутиращи мишки, обогатена с 0,5% TCA или 2% Colesevelam HCl е представена при 20-кратно увеличение. '*' Представлява перипортални хепатоцити; # представлява перицентрални хепатоцити.

Изображение в пълен размер

Зависими от времето ефекти на чревно-селективния Fxr дефицит върху чернодробния cyp7A1 и чревната експресия на Fgf15 \ t

Поради добре познатия дневен ритъм на експресия на чернодробен Cyp7A1, 3, 13, 23, ние изследвахме ефектите от дефицит на чревен FXR върху ежедневната чернодробна експресия на Cyp7A1 в четири различни времеви точки, т.е. в 0100, 0700, 1300 и 1900 часа . Не са наблюдавани разлики между половете (данните за мъжете не са показани).

В началото на тъмния период (1900 часа) експресията на черния дроб на Cyp7A1 е била най-висока и в двете групи, както се очаква (Фигура 3). Експресията на Cyp7A1 е значително по-висока само през нощта (1900 - 0700 часа) при iFXR-KO мишки в сравнение с WT контролите. Експресията на Cyp8B1, необходима за производството на холева киселина, не показва ясни вариации през нощта и не е повлияна значително при iFXR-KO мишки. Освен това не са наблюдавани разлики в експресията на Fxr и Shp в черния дроб между двете групи. Наблюдавайки този зависим от времето ефект на IFFR-дефицит върху експресията на Cyp7A1, попитахме дали отсъствието на чревна FXR и Fgf15 сигнализация действа чрез транскрипционни фактори (Dbp, Rev-erbα и/или E4bp4), участващи в регулирането на циркадната ритмичност на Cyp7A1. израз. Фигура 3 показва, че тези транскрипционни фактори показват различен циркаден профил в своя експресионен профил, но моделите на експресия са силно сходни и при двата щама. Само Dbp и Rev-erbα показват повишена експресия при WT мишки в даден момент (1900 часа), което очевидно не обяснява разликите в експресията на Cyp7A1 .

Циркаден профил на експресия на гени, участващи в регулирането на синтеза на жлъчна киселина. Нивата на генна експресия (в сравнение с експресията на 18S) са измерени в четири времеви точки (0700, 1300, 1900 и 0100 часа) при 6-7 женски контрола от див тип (отворени кръгове) или при женски чревни селективни FXR нокаут мишки (затворени кръгове). Данните са показани като средната стойност ± sd на Cyp7A1 и Cyp8B1 са ключови ензими в синтеза на жлъчна киселина, Shp е вторият пратеник на FXR и Dbp, Rev-erbα и E4bp4 участват в поддържането на циркадния ритъм на експресия на Cyp7A1. '#' Представлява значителна разлика с P

Циркаден профил на чревна генна експресия. Нивата на генна експресия (спрямо 18S) са измерени в четири времеви точки (0700, 1300, 1900 и 0100 часа) в terminal 4 cm терминален илеум, проксимален до илеоцекалния сфинктер, нито в контролен женски от див тип (отворени кръгове), нито в женски черва - селективни FXR нокаутиращи мишки (затворени кръгове); N = 4. Данните са изразени като средна стойност ± sd Fgf15 е растежен фактор, чиято експресия се индуцира от активния чревен FXR; Ibabp, белтък, свързващ илеалната жлъчна киселина, е чревен FXR целеви ген. '#' Представлява значителна разлика с P

Поток на жлъчката ( а ) и билярдно производство ( б - д ) при мишки от див тип (WT) и чревни селективни FXR нокаутиращи мишки, хранени или с обогатена с храна храна, 0,5% TCA или 2% Colesevelam HCl. След 0,5% диета, обогатена с TCA или 2% диета, обогатена с 2% Colesevelam HCl за съответно три и 7 дни, мишките (N = 5) бяха подложени на канюлация на жлъчката. В резултат на това бяха постигнати жлъчния поток и работата на жлъчните пътища. Отворени колони: WT съседи, затворени колони: чревни селективни FXR нокаут мишки. Стойностите са изразени като средна стойност ± sd '*' Представлява статистическа значимост P # е статистическа значимост (P

Ефекти от чревния селективен дефицит на FXR върху разграждането на [2H4] -холата ( а ), размера на контейнера б ), коефициент на частичен оборот ° С ) и скорост на синтез ( д ). Мишките бяха подложени на канюлация на жлъчката, както е описано в раздела Експериментални процедури. ( а - д ) са получени от измервания на обогатяване на изотоп на [2H4] -холат в плазма от див тип (WT) и чревно-селективни FXR нокаут мишки. N = 6 за щам: WT мишки (отворени решетки) и чревни селективни FXR нокаутиращи мишки (затворени решетки). Данните се изразяват като средна стойност ± SD # значителна разлика (P 30 пъти) и Fgf15 (> 30 пъти) израз в крайния илеум на контролата. мишка. Имаше относително малко увеличение на експресията на Shp в черния дроб, изключително при iFXR-KO мишки. Фигура 7 обаче показва ясна регулация надолу на експресията на Cyp7A1 и Cyp8B1 както при контролните, така и при iFXR-KO мишките, въпреки че понижаването на регулирането на Cyp7A1 не достига статистическа значимост при WT мишки.

Наблюдавахме последователно леко намаляване на телесното тегло при iFXR-KO мишки (

15%), които не са споменати от Kim et al. 16 Тъй като не са открити разлики в приема на храна или съдържанието на фекална енергия (данните не са показани), това вероятно ще отразява промените в консумацията на енергия при iFXR-KO мишки. Тази неочаквана последица от дефицита на iFXR в момента се разследва.

Добре известно е, че чернодробната експресия на Cyp7A1 показва подчертан дневен ритъм. Показано е, че експресията на 3, 13, 23 Cyp7A1 се увеличава изключително при iFXR-KO мишки по време на активния нощен период, когато експресията на Fgf15 е висока при WT мишки. Тъй като не са наблюдавани разлики между двете групи в експресията на чернодробни Fxr и Shp, това увеличение на Cyp7A1 при iFXR-KO мишки се дължи на тези мишки, експресиращи Fgf15 с ниско чревно черво, което е пряка последица от дефицита на FXR в червата, както е потвърдено. изследване на чревна експресия на Ibabp. Ние заключаваме, че чревният FXR чрез Fgf15 регулира синтеза на жлъчна киселина главно през нощта, което е в съответствие с Houten et al. 25, който показа, че чревният FXR е най-активен през нощта, използвайки трансгенната FXR луциферазна репортерна мишка. 25

Въпреки зависимия от времето ефект върху експресията на Cyp7A1, мишките iFXR-KO показват общ увеличен размер на пуловете с холева киселина. В резултат на това секрецията на жлъчна киселина беше увеличена, което от своя страна доведе до увеличен поток на жлъчката и отделяне на фосфолипиди. Това е в съответствие с резултатите на Yu et al. Тези автори съобщават, че мишките с дефицит на Fgfr4, т.е. без чернодробна сигнализация Fgf15, също показват увеличен размер на пуловете на жлъчните киселини и по-висока скорост на секреция на хепатобилиарна жлъчна киселина, отколкото контролите им.

След хранене с лека диета, обогатена с жлъчна киселина, секрецията на жлъчна киселина се увеличава и в двете групи, свързана с повишена секреция на фосфолипиди и холестерол. Тъй като чревният FXR е нарушен при iFXR-KO мишки, не очаквахме намаляване на чернодробната експресия на Cyp7A1 при тези мишки. Увеличението на жлъчните киселини обаче доведе до понижаване на регулирането на Cyp7A1, което не достига статистическа значимост при WT мишки и Cyp8B1 и при двата генотипа. Малко увеличение на експресията на ileal Fgf15 в комбинация с увеличаване на чернодробната експресия на Shp може да обясни наблюдаваното намаляване на експресията на Cyp7A1 при iFXR-KO мишки. По-важното е, че повечето от разликите между двата щама, наблюдавани в образуването на жлъчка, бяха сведени до минимум, което означава, че доста леко увеличение на потока на жлъчна киселина през черния дроб (+ 30%) има предимство пред регулаторната роля на чревния Fgf15.

След секвестирането на жлъчните киселини в чревния тракт, секрецията на жлъчна киселина намалява и в двете групи, което води до намален поток на жлъчката и фосфолипидите и секрецията на холестерол. В съответствие с обогатената с TCA диета, повечето от наблюдаваните разлики между двата щама в състоянието на хранене бяха сведени до минимум. На нивото на генна експресия секвестрацията на жлъчна киселина причинява намаляване на чревната експресия на Fgf15, което води до повишени нива на иРНК cyp7A1 и Cyp8B1 в черния дроб. Въпреки това, при WT мишки не може да се изключи приносът на намалена чернодробна експресия на Shp .

Нашето проучване показва, че производството на чревен FXR-медииран Fgf15 допринася за синтеза на жлъчна киселина, особено в тъмното, когато чревната FXR активност е висока. Нарушаването на чревния FXR води до увеличен размер на резервоара с холева киселина, което води до повишена секреция на жлъчна киселина и по този начин увеличава екскрецията на жлъчката и фосфолипидите. Модулирането на запасите на жлъчна киселина чрез добавяне или секвестиране на жлъчни киселини в чревния тракт минимизира ролята на чревната сигнализация FXR-Fgf15, налична при нормални диетични условия.