чернодробните

  • абстрактно
  • Основното
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • Животни и експериментален дизайн
  • Каспаза-3 активност
  • Хистопатологични и имунохистохимични методи
  • Хибридизация на място
  • Количествена PCR в реално време
  • Съдържание на чернодробен колаген
  • Статистически анализ
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Травма на черния дроб
  • Разширяване на чернодробните предшественици
  • Чернодробна фиброза
  • Възпаление на черния дроб
  • Фиброгенни чернодробни клетки
  • EMT LPC
  • ДИСКУСИЯ
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнително изображение S1
  • Допълнително изображение S2

абстрактно

Основното

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни и експериментален дизайн

Каспаза-3 активност

Чернодробните лизати се приготвят чрез хомогенизиране в хипотоничен буфер (50 mM HEPES pH 7, 5, 100 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM EGTA pH 8, 1 mM DTT, протеазен инхибиторен коктейл (Roche)). Хомогенатите се центрофугират при 10 000 g в продължение на 15 минути и извлечените протеини (50 μg) се анализират в дублирани експерименти чрез измерване на протеолитичното разцепване на флуорогенния субстрат Ac-DEVD-AFC върху каспаза-3 (Biomol) върху микроплака TriStar LB 941 четец (Бертолд). както вече беше описано. 30

Хистопатологични и имунохистохимични методи

In situ хибридизация

Допълнителна РНК сонда, специфична за α-фетопротеин (AFP) и TGFβ, беше синтезирана с помощта на комплект за маркиране на РНК на дигоксигенин (Roche Diagnostics). CRNA AFP сонди са получени от cDNA плъх плазмид (дарен от д-р JL Danan), усвоен с Xma I (антисенс) или SphI (смисъл) сонда) и транскрибиран от SP6 или T7 промотори. TGF β сондите са транскрибирани от cDNA фрагмент, получен чрез RT-PCR на плъх на черен дроб на ден 9 в модел AAF/частична хепатектомия, използвайки 5'-TACGTCAGACATTCGGGAAGCAGT-3 'и 5'-TGTACTGTGTGTCCAGGCTCCAAA-3' за картографиране на праймера. -576 и 1143-1131 от TGF β последователността на плъх (GI: 148747597) и субклонирани в плазмид pCR4-TOPO. TGF β cRNA сонди се транскрибират от T7 и T3 промоторите на Spe I (антисенс) или NotI (смисъл) усвоен плазмид и процедурите за маркиране, хибридизация и откриване се извършват в парафинови секции, както е описано по-горе. 31 Откриването на AFP или TGF β mRNA в последователни чернодробни участъци, оцветени с имунофлуоресцентен анти-СК19, както е описано по-горе, беше извършено при използване на стандартен протокол за хибридизация in situ върху замразени серийни участъци, нарязани до дебелина 5 μm (допълнителни материали).

Количествена PCR в реално време

Общата РНК беше изолирана от замразена чернодробна тъкан с помощта на RNeasy mini kit (Qiagen). Общо 2 μg бяха транскрибирани обратно от произволни хексамери, като се използва комплект за синтез на първа верига (Fermentas Life Sciences) и бяха извършени специфични аДМ усилвания, както беше описано по-горе 29, като бяха използвани праймерите, изброени в Таблица 1. Относителното количествено определяне на генната експресия беше извършено с помощта на Метод 2 - ACT и рибозомна 18S РНК нормализация и резултатите са изразени като кратна индукция в сравнение със стойностите, получени от контролни животни.

Маса в пълен размер

Съдържание на чернодробен колаген

Анализът на хидроксипролин се извършва, както е описано по-рано 32, като се използват малки фрагменти от различни лобове, които се събират, лиофилизират и хидролизират в 6 N НС1 при 110 ° С за една нощ. Съдържанието на чернодробен хидроксипролин се измерва спектрофотометрично, като се използва прясно приготвен реагент на Ehrlich и резултатите се изразяват в μg/mg тъкан (сухо тегло).

Статистически анализ

Чернодробно тегло, тРНК и белтъчен анализ (ALT, каспаза-3, хидроксипролин) бяха определени при всички животни в дублиращи се експерименти и стойностите са средни ± ± 4 - 9 отделни плъхове от всяка група и времева точка. Използвана е двойна ANOVA за оценка. ефект от всяко лечение в продължение на седмици, използвайки Bonferroni пост-тест. Използва се t-тест на Student за сравняване на разликите между двете групи. Извършени са статистически анализи с PRISM (GraphPad) и стойността на P * P ** P *** P

Увреждане на черния дроб и хистопатология. ( а ) Активността на ALAT в серума се повишава до ниво, което е сходно при плъхове, третирани с CCI4 и AAF/CCI4 и значително по-високо, отколкото при плъхове, третирани с AAF. Увеличението на флуорометричната активност на каспаза-3 е сходно в черния дроб на плъхове, лекувани или с CCI4, или с AAF/CCI4 и е значително по-високо при животни, лекувани с AAF. ( б ) Съотношението чернодробно тегло и телесно тегло е значително увеличено при лекувани с AAF/CCI4 плъхове след 6 седмици лечение в сравнение с останалите групи. # P * P ** P

Активиране на LPC дял. ( а ) Представителното откриване на имунофлуоресценция на CK19-позитивни клетки в чернодробни секции разкрива натрупване на LPC в лекувани с AAF (n = 4) и AAF/CCl4 (n = 9) плъхове, които възникват от порталните зони след 4 седмици и се разширяват вътре в лобовете след 6 седмици (първоначално увеличение × 200). Вложките показват по-голямо увеличение на обозначението CK19. Такова натрупване на LPC не се открива в групата CCl4 (n = 9), където маркирането на CK19 е ограничено до клетките на жлъчните пътища. ( б ) PCR в реално време разкрива увеличение на експресията на CK19 mRNA само в групите AAF и AAF/CCI4. ( ° С ) AFP иРНК, открита чрез in situ хибридизация (AFP AS сонда), беше ограничена до клетки на дуктуларен отговор при животни, лекувани с AAF и AAF/CCI4. Не се наблюдава специфичен сигнал при използване на AFP сонда (оригинално увеличение × 400). * показва портален тракт. Изображенията представляват три независими експеримента от три различни секции от черен дроб на плъх.

Изображение в пълен размер

Чернодробна фиброза

Изображение в пълен размер

Набиране и възпаление на макрофаги. ( а ) CD68 имунофлуоресцентно откриване (първоначално увеличение × 200) разкрива положителни клетки в целия чернодробен паренхим в групата на AAF, във влакнестата преграда след лечение с CCI4 и в цирозата на третираните с AAF/CCI4 животни. Цифрите представляват 4 (AAF) до 6 (CCI4 или AAF/CCI4) чернодробни секции. * обозначава портални трактове. ( б ) Количественото определяне на чернодробните CD68-положителни клетки от животни не разкрива значителна разлика в броя на чернодробните макрофаги в групите CCl4 и AAF/CCl4 след 4 или 6 седмици лечение. Данните са средно ± sem на отделен анализ на две полета за всяка чернодробна секция от 4 (AAF) до 6 (CCI4 или AAF/CCI4) индивидуални плъхове. Количествената RT-PCR не показва количествени разлики в експресията ( ° С ) TNF α или ( д ) CCR2 иРНК, което показва, че възпалителният отговор е сходен в трите групи.

Изображение в пълен размер

По време на чернодробно увреждане активираните макрофаги секретират множество цитокини, включително фактор на туморна некроза α (TNFα), които са митогенни за хепатоцитите 34, както и LPC. 35, 36 При лекувани с CCI4 плъхове, PCR в реално време разкрива постепенно, но ограничено (по-малко от 4-кратно) индуциране на TNFα иРНК (Фигура 4в) до ниво, което не се различава статистически в AAF и AAF/CCI4. групи. Още повече, че mRNA на мотива на CC мотив 2 (CCR2) рецептор на хемокин, който се експресира само в наети моноцити и някои Т клетки, не се различава в трите групи (Фигура 4г). Ниската и подобна степен на възпаление при тези три групи е в контраст със силната разлика в удължаването на фиброзата, което предполага, че в нашите експериментални условия възпалението не е играло основна роля във фиброгенния процес.

Фиброгенни чернодробни клетки

HSC или активиране на портални фибробласти. ( а ) Имунохистохимичното откриване на SMA-позитивни клетки разкрива лошо активирани HSC-свързващи портални съдове само след 6 седмици на приложение на CCl 4. За разлика от това, при плъхове, третирани с AAF/CCl4, редица положителни клетки бяха открити около зоните на портала на седмица 2, във фиброзната преграда на седмица 4 и в перинодуларните области на седмица 6. Не и SMA-положителни клетки бяха наблюдавани в дуктуларния отговор. AAF Group. Изображенията са представителни за 4 (AAF) до 9 (CCI4 или AAF/CCI4) чернодробни секции при първоначалното увеличение × 100. ( б ) След 6 седмици лечение с CCl 4, по-голямо увеличение (× 400) ясно показва SMA-позитивни клетки в централната фиброзна преграда, съдържащи значително отлагане на колаген, разкрито от оцветяване с червено пикросириус. За разлика от това, при лекувани с AAF/CCl4 плъхове, активирането на HSC или портални фибробласти е открито в началото на седмица 2 около LPC, което се случва в перипортални области, леко оцветени с микросириум в червено. На 6-та седмица бе отбелязано маркиране и SMA при преодоляване на фиброзна преграда с високо отлагане на колаген.

Изображение в пълен размер

Откриване на фиброгенни чернодробни клетки. ( а ) Детекция на имунофлуоресценция и SMA и десмин след 6 седмично лечение потвърждават активирането на HSC върху експресиращи миофибробласти и SMA в цироза на черния дроб на лекувани с AAF/CCl4 плъхове. Съобщава се за много малко и SMA-положителни HSCs във фиброзната преграда само след прилагане на CCl 4. Липса на активирани HSCs се наблюдава около порталните области в индуцирания от AAF дукален отговор. Представителни флуоресцентни микрофотографии на два експеримента върху чернодробни секции от два плъха във всяка група при първоначално увеличение × 200. ( б ) Количественият RT-PCR анализ разкрива повишена индукция на експресия на TGF-β иРНК при животни, третирани с AAF и AAF/CCI4 и ( ° С ) Откриването на TGF β mRNA чрез in situ хибридизация показа силен положителен сигнал в LPC в каналоподобни структури (вложката съдържа етикета на сензорната сонда) и в двете групи (първоначално увеличение × 400). ( д ) Двойното имунофлуоресцентно откриване на TGF β (зелено) и CK19 (червено) протеини в чернодробни секции от лекувани с AAF/CCI4 плъхове разкрива LPC, експресиращ TGF β в събраните изображения чрез конфокален анализ. Фигурите представляват два независими експеримента от три различни плъха във всяка група.

Изображение в пълен размер

EMT LPC

Имунолокализация на мезенхимни протеини до CK19-позитивен LPC при животни, третирани с AAF/CCI4 след 6 седмици лечение. а ) Представителни двойни имунофлуоресцентни изображения за CK19 (зелено) и миофибробластични маркери (червено) и SMA, десмин, FSP1 и колаген 1 от два експеримента от два плъха (първоначално увеличение × 200). В LPC не могат да бъдат получени комбиниращи сигнали между който и да е мезенхимен маркер и CK19. ( б ) Конфокалният анализ потвърди липсата на мезенхимни маркери в CK19-положителни LPC, които са заобиколени от desmin- и SMA-положителни клетки (× 630).

Изображение в пълен размер

ДИСКУСИЯ

Способността на LPC да се трансформира в миофибробласти чрез EMT е интересен въпрос. 51, 52, 53 Ролята на ЕМТ при фиброза е установена в белите дробове и в черния дроб, а в черния дроб също вече се съобщава за преход на хепатоцити, жлъчни клетки и HSC. 22, 23, 24, 25, 26 TGF β, който установихме, че се секретира от LPC, е добре познат EMT индуктор 22, 23, 25, който може да предизвика LPC преход по автокринен/паракринен път и да осигури нов потенциален механизъм на фиброза . Не успяхме обаче да демонстрираме експресията на мезенхимни маркери (т.е. α SMA, desmin и FSP1) в CK19-положителни LPC клетки от третирани с AAF/CCl 4 плъхове in vivo. Преходът на LPC, организиран в дуктуларни структури, в изолирани миофибробласти може да бъде трудно да се идентифицира чрез колокализация на епителни и мезенхимни маркери, особено ако загубата на епителни характеристики настъпи рано по време на EMT процеса. Поради тези причини доказателството за LPC, подложен на EMT in vivo, се нуждае от генетичен подход за картографиране на съдбата, за да се проследи съдбата на LPC по време на чернодробно увреждане. Независимо от това, преходът на LPC към миофибробласти след лечение с TGF β наистина е получен преди това in vitro, като се използва LPC, изолиран от плъхове, хранени с диета с недостиг на холин, допълнена с етионин. 53

В обобщение показваме, че разширяването на LPC влошава чернодробната фиброза. Този силен фиброгенен отговор изглежда не е пряката последица от хепатоцелуларни лезии или възпалителна реакция, но изглежда се дължи на натрупването на TGF β-продуциращ LPC, като по този начин стимулира миофибробластната трансформация на фибробласти и/или HSC в наранен черен дроб. Фиброгенните свойства на перипорталния LPC дават обяснение за развитието на преобладаваща перипортална фиброза, независимо какво е основното място на хепатоцелуларни увреждания, водещи до портоцентрални фиброзни прегради, прогресиращи до цироза.