елементи

абстрактно

Тиреоидит на Хашимото (HT), който се характеризира с производството на автоантитела срещу щитовидната жлеза, е локализирано автоимунно заболяване. Установено е, че HT има 55% съгласие при монозиготни близнаци. 1 Repplinger et al. 2 се посочва, че има висока честота на повишена честота на НТ при жените, която е седем пъти по-висока, отколкото при мъжете. В патогенезата на това заболяване участват различни генетични и екологични фактори. 3 Добре известно е, че хроничното възпаление, което възниква по време на НТ, причинява значително повишаване на нивата на цитокини и други възпалителни медиатори, което в крайна сметка води до разрушаване на щитовидната жлеза. 4 По-конкретно, взаимодействията на множество гени и фактори на околната среда могат да повишат чувствителността на НТ и тежестта на заболяването. 5

Поли (ADP-рибоза) полимераза-1 (PARP-1) се счита за един от кандидат-гените, отговорни за патогенезата на възпалителни ситуации. Смята се, че PARP-1 играе важна роля в инициирането на пътя за възстановяване на ДНК, въпреки че високите нива на неговото активиране също са свързани с повишена апоптоза. Наскоро беше показано, че развитието и прогресирането на възпалителни заболявания е нарушено при нокаутиращите модели на PARP-1, които използват инхибитори на PARP-1. 6, 7 Резултати от няколко проучвания показват, че инактивирането на PARP-1 предпазва от ендотоксичен шок, колит, пневмония и други заболявания като мозъчно-мозъчна травма, мозъчна и миокардна исхемия, инсулт, ревматоиден артрит и сърце, свързани със захарен диабет. заболявания. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Въпреки че точната роля на PARP-1 в възпалителната каскада все още не е известна, всички налични проучвания върху PARP-1 предполагат, че този ген е силен кандидат и генетичен фактор за разработка на HT.

Доказано е, че генът PARP-1 (OMIM 173870), разположен върху хромозомата (1q41-43), съдържа алелни полиморфизми, които са свързани с податливост към различни заболявания, някои от които са възпалителни. В допълнение, множество места за свързване на транскрипционен фактор са идентифицирани в промоторния регион на гените PARP-1; следователно генетичните варианти в този регион могат да повлияят експресията на PARP-1. 17 Няколко варианта (C410T (rs2793378), Poly (A) n, C1362T и G1672A (rs7527192)) са идентифицирани в промоторната област и има няколко изследвания, които изследват връзката между тези промоторни полиморфизми и патогенезата на много заболявания. мястото на T2444C (rs1136410) (известно също като Val762Ala), което причинява промяна в T към C, Val до Ala в екзон 17, е идентифицирано от Cottet et al. 18 Според Уанг и колеги, полиморфизмът T2444C намалява ензимната активност на PARP-1 чрез

В това проучване попитахме дали два промоторни полиморфизма (rs2793378 и rs7527192) и полиморфизъм на активно място (rs1136410) в гена PARP-1 могат да предразположат индивидите към HT болест в турската женска популация.

Пациенти и методи

Учебни предмети

В това проучване бяха включени сто четиридесет и една жени, които бяха диагностицирани с НТ в амбулаторията за ендокринни и метаболитни заболявания в Медицинския университет Cerrahpasa в Истанбул. Контролната група се състоеше от сто и петдесет здрави жени на средна възраст. Критериите за изключване за участие в проучването включват бременност, тютюнопушене, употреба на лекарства с рецепта или лекарства и автоимунно заболяване, което може да повлияе на резултатите от проучването.

Въпреки че турците са етнически разнообразни, всички случаи и контрол са внимателно подбрани от европейската страна на Истанбул, за да се гарантира, че всички лица са от турски произход. Всички участници в изследването не са свързани и са получили подписано информирано съгласие преди вземането на проби и събирането на данни. Протоколът за изследване е одобрен от Институционалната комисия по етика на Медицинското училище Cerrahpasa, Университет в Истанбул.

Генотипизиране на полиморфизмите на PARP-1

Геномна ДНК от изследваните субекти се изолира, използвайки метода на утаяване с етанол. Концентрацията и чистотата на ДНК се измерват на NanoDrop спектрометри (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) и се определят, като се използва оптична плътност 260/280 nm. Генотиповете на PARP-1 C410T и G1672A се определят, като се използва метод на полиморфизъм с дължина на рестрикционен фрагмент (RFLP). Праймерите, използвани за усилване на полиморфните места, са F: 5'-TCCAGTGGCACTATCAT-3 'и R: 5-GTTGTGAGACATAGGCCGAATC-3' за rs2793378 и F: 5'-GCGAGACCCTGTCCCTAA-3 'и R: 5-TCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 16.

Продуктите за амплификация дават фрагмент от 298 базисни двойки (bp) за rs2793378 и фрагмент от 187 bp за rs7527192. Десет микролитра от продукт за усилване на rs2793378 се усвояват с една единица Hpy31 (Dde I) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), инкубира се в продължение на 12 часа при 37 ° С и се електрофорезира за 30 минути при 120 V. на 3% агароза гел. Хомозиготността на общия алел (представен от генотипа СС) е посочена от ленти 145 и 109 bp, докато хомозиготността на варианта алел (представен от генотипа TT) е представена от ленти 127 и 109 bp. Десет микролитра от амплифициращ продукт rs7527192 се усвояват с една единица Bsh1236I (BstUI) (MBI, Fermentas, Вилнюс, Литва), инкубира се в продължение на 12 часа при 37 ° С и се отделя върху 3% агарозен гел. Хомозиготността на общия алел (представен от GG генотипа) е показана от ленти 152 и 35 bp, докато хомозиготността на варианта алел (представен от генотип AA) е представена от една лента от 187 bp, тъй като този полиморфизъм унищожава сайт за ограничение за Bsh1236I. 20.

За rs1136410 условията на PCR бяха определени на 95 ° C за 4 минути за денатурация, последвани от 35 цикъла от 94 ° C за 30 s, 62 ° C за 45 s и 72 ° C за 45 s за етапа на отгряване, последвано от окончателно удължаване при 72 ° C за 10 минути. Използваните грундове са както следва: директен грунд 5'-TGAGGAAGGCCTGACCCTGT-3 'и обратен грунд 5'-TGACCAGCAGGAGGGTTTGC-3'. Промените в последователността за rs1136410 бяха определени с помощта на двупосочно секвениране. Последователностите на Amplicon бяха оценени с помощта на CLC Workbench 3.6.1 (Дания).

Анализ на хаплотипа

Хаплотипите са генерирани от генотипни данни. Анализите на дисбаланса на свързване (LD) и хаплотипа бяха извършени с помощта на Haploview 4.2, който използва алгоритъма за максимизиране на очакванията (EM).

Обработка и анализ на данни

резултатът

Проучване на популацията

Общо 141 пациенти с тиреоидит на Хашимото на възраст от 39 до 55 години (средно 48,9 години) и 150 контроли на възраст от 37 до 54 години (средно 46,6 години) са били включени в това проучване. Няма значителна разлика между възрастта на случая и контролите.

Установено е, че средните нива на тиреоид стимулиращ хормон (TSH), antiTPO и antiTG антитела при пациенти с НТ са 8,3 ± 6, 8 μIUU/ml, 806, 7 ± 447, 3 IU/ml и 382, ​​7 ± 207,4 IU/ml. Нивата на TSH, AntiTg и AntiTPO антителата при контролните субекти са 2,8 ± 1, 2 IU/ml, 65,4 ± 59,7 IU/ml и 27 ± 15,8 IU/ml. Нивата на антитела на TSH, AntiTPO и AntiTG при пациенти с НТ са били статистически по-високи от контролната група от очакваното (P = 0, 0305, 0, 0296, 0, 0242).

141 пациенти с НТ и 150 контролни субекта бяха тествани за rs2793378, rs7527192 и rs1136410. Няма статистически значими разлики между пациентите и контролите по отношение на средната възраст (41,1 ± 11,7 години, P = 0,352), пола (всички жени, P = 0,881) и етническата принадлежност (турци), което показва, че честотата, съответстваща между групите.

Разпределение на PARP-1 SNP в HT

Разпределението на генотипове rs2793378, rs7527192 и rs1136410 в контролната група беше в HWE. Разпределението на генотипа и честотата на алелите на всички изследвани полиморфизми са показани в Таблица 1.

Маса в пълен размер

Открихме значителна връзка между PARP-1 rs1136410 и rs7527192 и HT. Честотата на хетерозиготния TC генотип rs1136410 е значително по-висока при контролите в сравнение с пациентите (OR: 2, 504, 95% CI: 1, 48-4, 23, P = 0.001). Освен това беше установено, че честотата на алела C rs1136410 е статистически по-висока в здравата група (OR: 1,632, 95% CI: 1, 1-2, 403, P = 0,013) и rs1136410 запазва значението си след корекция на Bonferroni. Честотата на хетерозиготния GA генотип rs7527192 е значително по-висока при контролите (OR: 1, 633, 95% CI: 1, 017-2, 623, P = 0.042), отколкото при пациентите. Освен това е установено, че честотата на алела A rs7527192 е статистически по-висока в здравата група (OR: 1.492, 95% CI: 1, 039-2, 122, P = 0.03); въпреки че нито GA генотипът, нито A алелът от rs7527192 запазват значение след корекция на Bonferroni. В допълнение, С-алелът на rs1136410 не показва значимост след корекция на Bonferroni, а PARP-1 rs2793378 не показва защитен или опасен ефект при HT заболяване. Всички резултати са показани в таблица 1.

Хаплотипен анализ на PARP-1 SNP

Също така изследвахме дали тези три полиморфизма са в неравновесие при свързване и някакви често срещани хаплотипове, свързани със заболявания и редки хаплотипове (с честота 5%).

Преобладаването на CGC хаплотипа е значително по-високо при контролите (съотношение случай към контрол: 0,061: 0, 146, P = 0, 0252, x 2 = 5,01), както е показано в Таблица 2. Първият маркер на CGC хаплотипа, C - Алелът е див тип за RS2793378. Вторият маркер на CGC хаплотипа, алелът G, е див тип за rs7527192. Третият маркер, алел С, е мутант за rs1136410. Разликата се основава на трети маркер, алелът C rs1136410, който служи като защитен фактор. Тъй като обаче това проучване се основава на малък размер на извадката, ние използвахме корекция на Bonferroni, за да намалим грешката от тип I. След корекцията на Bonferroni анализът на хаплотипа не показа значимост. В допълнение, два SNP в PARP-1 (rs1136410 и rs7527192) са в силна LD (Фигура 1).

parp-1

Сдвояване на несъответствие на неравновесна диаграма за изследваните PARP-1 SNP. По-високата стойност на r 2 показва по-тъмен цвят. Позицията на PARP-1 хромозома rs2793378 сайт е 226597341, сайт rs7527192 е 226596079 и сайт rs1136410 е 226555302.

Изображение в пълен размер

Комбиниран анализ на PARP-1 SNP генотипове

Таблици 3, 4, 5 обобщават проучванията за асоцииране между комбинираните генотипове на трите SNP и общия риск за НТ. SNP на PARP-1 rs2793378 и rs7527192 показват статистическа значимост между комбинираните генотипове при пациенти с НТ и контролите. Комбинираните честоти на генотиповете CC/GA, CT/GG и TT/GA са значително по-високи в контролната група в сравнение с групата HT в сравнение с комбинирания генотип CC/GG (OR: 2, 956, 95% CI: 1, 114–7, 840, P = 0,027, OR: 2, 66, 95% CI: 1, 13 - 6, 259, P = 0, 023, OR: 4, 644, 95% CI: 1, 455 - 14, 822, P = 0, 007, съответно). След корекция на Bonferroni, само комбинираният генотип TT/GA остава значим и се установява, че е значителен защитен фактор срещу HT болест (P = 0,007), както е показано в таблица 3.

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

Освен горните резултати, няма други значими разлики между множествените сравнения на rs7527192-rs1136410 и rs2793378-rs1136410 при пациенти с НТ и контролни групи (Таблици 4 и 5).

дискусия

Въз основа на проучвания за асоцииране на щитовидната жлеза (GWAS) е ясно, че генетичните фактори са важен фактор за функцията на щитовидната жлеза и автоимунитета. Наскоро беше установено, че интронен вариант на VAV3 (вав3 гуанин нуклеотиден обменен фактор, rs12126655) е свързан с концентрациите на TSH, а друг вариант (rs2071403), разположен на 75 bp близо до изходното място за транслация на TPO, е значително свързан с плазмените анти-TPO антитела . Друг интронен вариант на HLA-DPB2 (rs733208) също е свързан с позитивност на анти-TPO антитела. 21 Eriksson et al. 22 демонстрира връзка между хипотиреоидизъм и автоимунно заболяване на щитовидната жлеза с SNPs в HLA клас I и II региони (rs2517532 и rs2516049, съответно) и в близост до CAPZB (затварящ протеин (актинови влакна) на Z-линия мускули, бета, rs1209EB47 Gs) фосфодиестераза 8В, rs4704397) и CTLA-4 (токсичен Т-клетъчен антиген-4, rs231779). Въз основа на кандидат-генни проучвания, CTLA-4 е известно, че е широко свързан с много други автоимунни заболявания, включително автоимунен хипотиреоидизъм.

В допълнение, варианти като FOXE1, фактор на транскрипция на щитовидната жлеза, са идентифицирани като генетични рискови фактори за първичен хипотиреоидизъм. В GWAS от FoxE1 беше предложено FoxE1 и PARP-1 да участват в човешкия NIS репресорен комплекс, който е транзактивен транскрипционен репресор, открит в клетки на карцином на щитовидната жлеза, който съдържа PARP-1 и функционира чрез своята поли (ADP-рибозилна активност). . Следователно, PARP-1 е мощен и подходящ кандидат-ген за идентифициране на асоциации между генетични фактори при автоимунитет на щитовидната жлеза.

Няколко проучвания категорично подкрепят факта, че PARP-1 играе важна роля при автоимунни възпалителни заболявания. PARP-1 инхибиторите или PARP-1 делециите се използват в много терапевтични подходи, които се основават на тъканна блокада или системно възпаление. 28, 29 Наскоро бяха предложени алтернативни пътища, включващи способността на PARP-1 да регулира транскрипцията на гени, свързани с възпаление. Няколко скорошни публикации показват, че ядреният протеин PARP-1 регулира транскрипцията и синтеза на възпалителни медиатори. В допълнение, връзката между активността на PARP-1 и възпалението е широко проучена и връзката с възпалението е твърдо установена чрез фармакологично инхибиране на активността на PARP-1, което подобрява възпалителния отговор. 6, 30 Инхибирането на активността на PARP-1 е защитно при широк спектър от възпалителни състояния, като сърдечно-съдови заболявания, диабет, ревматоиден артрит и инсулт. 13, 31 Следователно, генът PARP-1 може да бъде силен кандидат въз основа на наблюдения, направени при нокаутиращи мишки и предоставя обещаващи терапевтични подходи за възпалителни заболявания, използващи инхибитори на PARP-1. .

Като алтернатива, концентрацията на PARP-1 протеин се контролира чрез директно регулиране на промоторната активност. Следователно, полиморфизмите в промоторната област могат също да повлияят на активността на PARP-1. В промоторната област бяха идентифицирани множество сайтове за транскрипция, както и 3 комплекта CCAAT/TATA кутии, които осигуряват свързващо място за YY1 транскрипционни фактори. Освен това в този регион са идентифицирани четири вариации на последователността: rs2793378, Pol (A) n, C1362T и rs7527192. 16, 20 Според Infante et al., 32 полиморфизмът C410T, който е в хетерозиготно състояние, повишава риска от болестта на Паркинсон, докато хетерозиготността на rs7527192 значително забавя началото на болестта. В това проучване не открихме никакво значение по отношение на rs2793378.

Наскоро rs2793378, rs7527192 и rs1136410 са изследвани при много възпалителни автоимунни заболявания, включително RA, 16 AR, 33 астма, 34 нефрит и артрит при пациенти със СЛЕ 35 и болест на Алцхаймер, 36, 37, както е описано по-горе. В нашето проучване беше установено, че хетерозиготният GA генотип PARP-1 rs7527192 има защитен ефект върху HT болестта в турската популация. Това е сравнима с резултатите на Infante et al., Които показват, че някои вариации на промотора (rs2793378 и rs7527192) са свързани със защитата срещу болестта на Паркинсон. Също така по-рано установихме, че хетерозиготният генотип rs7527192 е значително свързан със податливостта към алергичен ринит (AR) в турската популация. В допълнение, в това проучване, според множество сравнения на комбинираните генотипове rs2793378 - rs7527192, честотата на комбинирания генотип TT/GA е значително по-висока в контролите в сравнение с групата НТ в сравнение с комбинирания генотип CC/GG. След корекцията на Bonferroni само генотипът TT/GA продължава да показва значение като защитен фактор. Когато мутантната форма на rs2793378 и хетерозиготната форма на rs7527192 се комбинират, се наблюдава значителен защитен ефект при пациенти с НТ.

Доказано е също, че хаплотиповете на промотора на PARP-1 са свързани с чувствителност към някои хронични възпалителни заболявания, като AR, RA и целиакия. Установен е и защитният ефект на хаплотипа на полиморфизма на гена PARP-1 върху болестта на Алцхаймер. 37 хаплотипа rs2793378, rs7527192 и rs1136410 не са свързани с повишен риск от AR. 33 Според Pascual et al. 16-те хаплотипа на PARP-1 (-410, -1327, CA микросателитно повторение) играят роля за чувствителността на RA в испанската популация, докато вариантът rs7527192 не изглежда да е част от този хаплотип. Въпреки че беше установено, че CGC хаплотипът има защитен ефект, основан на алела C (Ala) rs1136410, той не оцелява корекцията на Bonferroni.

rs1136410 присъства в около 5-33% от цялото население. 19 По-рано съобщавахме, че алелът T (Val) на rs1136410 е свързан с повишен риск от астма. В допълнение, rs1136410 е значително свързан с исхемична болест на сърцето, която също е възпалителен процес. 39 Hur et al. 35 демонстрира, че несинонимният вариант + 40329T → C (V762A) също е значително свързан с повишен риск от артрит при корейски пациенти със СЛЕ. Въпреки това, според Onaran et al., 40 rs1136410 не са свързани с риск от ревматоиден артрит. Установено е също, че вариантите на Val762 PARP-1 rs1136410 увеличават риска от диабетна полиневропатия при пациенти с диабет тип 1. Освен това установихме, че хетерозиготният TC (Val/Ala) генотип rs1136410 има защитен ефект върху чувствителността на НТ в турската популация дори след корекция на Bonferroni.

Смята се, че PARP-1 и ядреният фактор kappa B (NF-κB) играят важна роля при възпалителни заболявания. Доказано е, че PARP-1 може да действа като коактиватор на NF-κB по отношение на възпалителни процеси в клетката. Тези открития ни предоставиха нови прозрения в патогенезата на различни възпалителни заболявания, като HT. Преди това съобщихме, че честотата на алела на делеция NF-κB rs28362491, който придружава високи нива на интерлевкин-6 (IL-6), е значителна в групата на пациентите с НТ. 43 Това проучване се основава на предишните ни изследвания.

Освен това трябва да се има предвид, че малкият размер на извадката, който може да е повлиял на статистическата мощ на нашите анализи, може да се счита за ограничение на това проучване. Въпреки че проучване с ниска статистическа мощност има намален шанс да разкрие реален ефект, проучванията за контрол на случаите с малки размери на извадката все още се използват широко и могат да бъдат използвани за оценка на предварително идентифицираните области на кандидати в извадката и по-точно определяне на целите за подбор, по-голямата проба или репликационното проучване осигуряват сигурност за по-нататъшни изследвания.

PARP-1 е необходим за активиране на няколко транскрипционни фактора чрез възпаление на няколко медиатори. Предполага се, че различен механизъм на свързване и активиране на PARP-1, дължащ се на хетерозиготния генотип rs1136410, може да повлияе на експресията на гени, участващи във възпалителния отговор, вероятно чрез променен възпалителен път. Следователно, този полиморфизъм може да осигури защитен ефект срещу HT. Тази хипотеза обаче все още изисква допълнително проучване.

В обобщение, възможно е взаимодействията на генните варианти на PARP-1 да играят ключова роля при организирането на различните промени, които се случват по време на възпалителния отговор при HT заболяване. Необходими са обаче репликационни проучвания или други функционални проучвания с по-големи размери на пробата, за да се потвърди предполагаемата защитна роля на тези варианти на гена PARP-1. По-конкретно, по-големи изследвания и репликационни проучвания, включващи различни етнически групи, се препоръчват силно, за да се определи правилно връзката между полиморфизмите на PARP-1 (особено rs1136410 TC) и развитието на НТ, както и прогнозата на заболяването.