елементи

абстрактно

Преди това нашата група демонстрира силна връзка между повишената плазмена CD13 ензимна активност и новодиагностицираната обширна хронична GVHD (cGVHD) при деца. Тъй като цитотоксичните анти-CD13 Abs са документирани след трансплантация на кръв и костен мозък (BMT) във връзка с CMV и cGVHD инфекция, ние предположихме, че разтворимият CD13 допринася за патогенезата на cGVHD, като индуцира CD13 реактивен Abs и че анти-CD13 Abs може да бъде допълнителни биомаркери за новодиагностицирани с обширен cGVHD. Използвайки проспективно събрани плазмени проби от педиатрични алогенни пациенти с BMT (allo-BMT) с cGVHD и контроли без cGVHD, включени в голямо терапевтично проучване с много институции от педиатричната онкологична група cGVHD, ние оценихме дали разтворимият CD13 корелира с индукцията на анти-CD13 Abs. Установихме, че CD13 реактивен Ab присъства в дела на пациентите след ало-BMT, но изглежда не корелира с наличието на разтворим CD13. Anti-CD13 Abs също не отговаря на нашите критерии като диагностичен биомаркер за cGVHD. Тези данни не потвърждават, че индукцията на CD13-реактивен Abs е механизъм за cGVHD при деца, нито е част от патогенезата на cGVHD, свързана с повишен разтворим CD13. Точната роля на CD13 в cGVHD остава да бъде определена.

Материали и методи

елементи

Периферни кръвни проби бяха събрани и оценени проспективно от субекти, включени в педиатричното онкологично клинично изпитване ASCT0031, рандомизирано, плацебо контролирано, двойно-сляпо, фаза III проучване, което оценява два режима на лечение за педиатрични пациенти с новодиагностициран обширен cGVHD, както е описано по-горе. 7 пациенти, записани и лекувани за ASCT0031, образуват експериментална група (n = 52). За да се контролира възстановяването на имунната система след ало-BMT, беше проведено съпоставяне по време с контролната група (n = 28) за субекти с cGVHD, с дни след ало-BMT по време на диагнозата cGVHD, използвани за разделяне на експерименталната група на първоначална cGVHD трансплантация) или късно настъпване на cGVHD (

9 месеца след трансплантацията) и в сравнение с контролните пациенти без BMT без cGVHD от 6 (рано) и 12 месеца (късно) след BMT. За сравнение бяха оценени здрави доброволни контроли на нетрансплантирани кръводарители (n = 6).

Оценени проби

Периферна кръв се събира от пациенти с cGVHD при влизане в проучването (време на диагностициране на cGVHD) и от контролни субекти, събрани на 6 и 12 месеца (след трансплантация). Пробата се разделя на клетки и плазма след центрофугиране и се съхранява при -80 ° C. Замразената плазма се размразява във водна баня с температура 37 ° C и се ултрацентрифугира (15 000 rpm за 5 минути), за да се отстрани утайката, когато е готова за употреба. След нашия предишен анализ на биомаркери 7, малцинство от пациентите не са имали достатъчен плазмен обем за анализ на анти-CD13 Ab и не са били включени в този анализ. Налична е адекватна плазма за анти-CD13 Ab анализ (45 cGVHD проби и 26 ELISA контроли; 42 cGVHD проби и 23 Cellomics контроли, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ).

Разтворим CD13 (аминопептидаза N) ензимен анализ

Плазмените проби бяха анализирани за разтворима активност на CD13 (аминопептидаза N), както е описано по-горе. 7 Резултатите от разтворимата CD13 активност, които бяха публикувани в нашата група 7, бяха използвани за корелационни изследвания срещу анти-CD13 Abs.

ELISA за анти-CD13

Cellomics за анти-CD13

Проби (30 μl) се разреждат 1: 5 в PBS (120 μl) и се добавят към 96-ямкови плаки, съдържащи нетрансфектирани ендотелни клетки на миши хемангиоендотелиом (клетъчна линия EOMA) и се инкубират в продължение на 2 часа при стайна температура, за да се намали неспецифичното свързване Плаките се центрофугират (800 rpm за 5 минути) и се събират 100 μl супернатант. Супернатантата се добавя към 96-ямкови плаки, съдържащи трансфектирани с плазмид EOMA клетки, експресиращи човешки CD13 Ag, и се инкубира в продължение на 2 часа при стайна температура. След това ямките бяха измити три пъти с PBS и конюгиран с FITC миши анти-човешки Ig (специфичен за човешки IgG) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Канада) беше добавен, инкубиран за 30 минути и измит с PBS. MoAb WM15 е използван като положителна контрола (разреждане 1:50 с използване на 2 μl WM15 и 98 μl PBS) и MoAb изотип IgG 1 мишка (Ancell, Bayport, MN, USA) е използван като отрицателна контрола, последвана от FITC-конюгирани анти- миши IgG 1. HOECHST 33342 багрило (Sigma-Aldrich) при 1 ug/ml се използва за откриване на EOMA клетъчна ДНК. Интензитетът на FITC на всяка ямка е отчетен от ArrayScan Reader 4.5 (Cellomics) и средният интензитет на FITC на клетка, използван като маркер на анти-CD13 Abs.

Статистически анализ

Както е дефинирано по-горе, анти-CD13 Abs се считат за биологично и клинично значими, ако са изпълнени следните два критерия: (1) 100% по-високи или 50% по-ниски в сравнение с контрола (± 5%) и (2) статистическа значимост с P- стойност на 7 Описателни статистически данни бяха генерирани за всички данни, използвайки Prism версия 5 за компютър (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ) или SPSS (версия 15.0, Чикаго, IL, САЩ). Значимостта на наблюдаваните промени се определя с помощта на t-критерия на Student и 95% доверителни интервали на изразената разлика. Всички P стойности

деца

Сравнение на анти-CD13 Abs с използване ( а ) ELISA a ( б ) Келомика между предметните групи (P = NS за всички). ELISA използва свински CD13 като Ag и OD за измерване на относителния анти-CD13 Ab. Целомичният анализ използва човешки CD13 като Ag и средния интензитет на FITC на клетка за измерване на относителния анти-CD13 Ab.

Изображение в пълен размер

Някои проби както от cGVHD, така и от контролни проби в теста Cellomics имат високи нива на анти-CD13 в сравнение със здрави доброволци (Фигура 1b). Използвайки положителна граница на анти-CD13 като средна интензивност на FITC на клетка плюс 2 sd за здрави доброволци, не открихме значителна разлика в положителните анти-CD13 Abs между ранните cGVHD (14 от 32, 44%) и ранните контроли (5 от 5) 22, 23%) (разлика 21%; 95% доверителен интервал: -3,5 до + 45,6%). По подобен начин няма значителна разлика в късния cGVHD (7 от 10, 70%) в сравнение с късните контроли (5 от 12, 42%) (разлика 28%; 95% доверителен интервал: -11,5 до + 68,1%). Не е открита връзка между анти-CD13 Abs (положителен или отрицателен) и анамнеза за остър GVHD, нито конкретно място на засягане на cGVHD (кожа, орално, очно, стомашно-чревно, чернодробно, белодробно или мускулно-скелетно) (данните не са показани).

Корелация на анти-CD13 Abs с активността на sCD13

За да се оцени дали разтворимият CD13 корелира с индукцията на анти-CD13 Ab, беше извършен корелационен анализ, използвайки данни от Cellomics и разтворима CD13 ензимна активност. Няма корелация с активността на разтворимия CD13 ензим и анти-CD13 Ab (Фигура 2; r стойности: 0, 03, -0, 06, -0, 34 и 0, 15 за ранен cGVHD, ранни контроли, късен cGVHD и късни контроли).

Сравнение на нивата на анти-CD13 Ab в клетки Cellomics с активност на sCD13 при пациенти с ( а ) cGVHD ( б ) α-BMT, но не cGVHD (кръв, събрана 6 месеца след BMT; ранни контроли) ( ° С ) късно настъпване на cGVHD ( д ) ало-BMT, но не cGVHD (кръв, събрана 12 месеца след BMT; късни контроли).

Изображение в пълен размер

дискусия

След неотдавнашна демонстрация, че разтворимият CD13 силно корелира с новодиагностициран екстензивен cGVHD при деца, 7 в комбинация с предварително идентифицираната връзка на анти-CD13 Abs с CMV инфекция 11 и cGVHD 12 след BMT, ние се опитахме да определим дали разтворимият CD13-индуциран CD13 реактивен Абс. като механизма, лежащ в основата на cGVHD. Нашият анализ показва, че разтворимият CD13 не допринася за патогенезата на cGVHD чрез индукция на CD13-реактивен Abs, нито анти-CD13 Abs биомаркерите за екстензивен cGVHD.

Нашето разпространение на анти-CD13 Abs (23-70%) е в съответствие с предишни съобщения за анти-CD13 Abs (45%) след BMT. В това предишно проучване анти-CD13 Ab се открива само при CMV виремия или заболяване. Данни за серологията на донора/реципиента на CMV и CMV инфекцията след BMT в нашето проучване не бяха събрани, което направи невъзможно да се оцени връзката между анти-CD13 и CMV инфекция. Anti-CD13 неутрализира CMV инфекцията, като взаимодейства с асоцииран с вирион CD1316 и тези Abs се появяват при CMV откриване. Следователно, наличието на анти-CD13 Abs може да бъде свързано с реактивиране на CMV след ало-BMT за разлика от cGVHD.

Механизмът на повишен разтворим CD13 в cGVHD остава неясен. Свързаният с мембрана CD13 се експресира екстензивно върху няколко типа тъкани, включително тези, засегнати от cGVHD. 9, 10 Разтворим CD13 може да бъде неспецифичен страничен продукт от интензивно възпаление на тъканите. Алтернативно, аминопептидаза N се експресира съвместно с молекули MHC II в редица професионални APCs 17, а моделът на NH2-терминалната последователност на пептиди, свързани с MHC клас II, може да повлияе на in vivo обработката на Ag. 18.

И накрая, демонстрирахме, че разтворимият CD13 в cGVHD не индуцира анти-CD13 Abs, въпреки че Abs има при някои пациенти след ало-BMT. Механизмът на CD13 в патогенезата на cGVHD остава неясен, но може да включва медииране на възпалителни отговори от Т клетки.