елементи

абстрактно

Kappa глутатион трансфераза (GSTK1-1), наричан още Dulfide Bond-подобен оксидоредуктазен протеин (DsbA-L), участва в пост-транслационната мултимеризация на адипонектин и е в отрицателна корелация със затлъстяването при мишки и хора. Изследвахме адипонектин при Gstk1 -/- мишки и изненадващо не открихме разлики в общите серумни нива на адипонектин или мултимерни нива с високо молекулно тегло (HMW) в сравнение с нормалните контроли. Нередуциращата SDS-полиакриламидна гел електрофореза и Western blot също показват подобно разпределение на ниски, средни и HMW мултимери при нормални и Gstkl -/- мишки. Вариацията на адипонектин корелира с глюкозния толеранс и нивата на фосфорилирана AMP-киназа, но установихме сходен глюкозен толеранс и сходни нива на фосфо-5-AMP-активирана протеин киназа при нормални и Gstkl -/- мишки. Следователно, нашите открития показват, че GSTK1-1 не е абсолютно необходим за мултимеризация на адипонектин in vivo и при липса на GSTK1-1 могат да се активират алтернативни пътища.

капа

Адипонектинът е адипокин, секретиран предимно от бяла мастна тъкан, която има различни роли в регулирането на метаболизма на глюкозата и мастните киселини, като предизвиква окисляване на мастните киселини, потиска чернодробната глюконеогенеза и повишава чувствителността на черния дроб и мускулите към инсулина. Ниските нива на циркулиращ адипонектин са свързани със затлъстяването и инсулиновата резистентност, 2, 3 и високите нива корелират със защитата срещу свързани със затлъстяването патологии, включително диабет тип 2 и метаболитен синдром, хипертония 4, атеросклероза 6 и безалкохолна мастна чернодробна болест. 7 Адипонектинът циркулира в кръвта като трите основни дисулфидно свързани олигомерни форми; тример с ниско молекулно тегло, хексамер със средно молекулно тегло и 12-18 мултимери с високо молекулно тегло. Съществуват значителни доказателства, че различните олигомери имат различни биологични функции. 1, 8

Неотдавнашно проучване в 3T3-L1, 9 клетки съобщи, че олигомеризацията на адипонектин се насърчава от глутатион трансфераза (GSTK1-1) kappa и че нокдаунът на GSTK1-1 значително намалява нивата на секретиран HMW адипонектин в адипоцитите на 3T3-L1. GSTK1-1 се експресира в различни тъкани, включително бяла мастна тъкан, основен източник на адипонектин in vivo. 9, 10, 11 Експресията на GSTK1-1 също е в отрицателна корелация със затлъстяването при мишки и хора и поради това е предложена като нова цел за разработване на лекарства за лечение на инсулинова резистентност и свързани метаболитни нарушения. 9

Въпреки че GSTK1-1 има глутатион трансферазна активност като цитозолни GST, той е локализиран в митохондриите и пероксизомите 12 и структурата му се различава значително от тази на цитозолните и микрозомалните GST. Kappa GSTs показват подобна гънка като бактериалните дисулфидни образуващи връзки протеини, като дисулфидно свързана оксидоредуктаза А (DsbA). 11, 13, 14 Структурното сходство на GSTK1-1 с DsbA доведе до мнението, че той трябва да бъде преименуван на DsbA-Like (DsbA-L); Той обаче е подобен на бактериалните изомерази на 2-хидроксихромен-2-карбоксилат. Въпреки че показахме, че GSTK1-1 има значителна глутатион трансферазна активност in vitro, 13, разработихме нокаутиращи мишки GstK1, за да изследваме биологичната му роля in vivo. Забелязахме, че дефицитът на GSTK1-1 причинява гломерулна нефропатия, включително промени в базалната мембрана, процеса на подоцитите и микроалбуминурия. Интересното е, че този фенотип е подобен на този, открит при мишки с дефицит на адипонектин, които показват албуминурия и сливане на подоцитни процеси. 16.

Като се има предвид очевидната роля на GSTK1-1 в олигомеризацията на адипонектин и сходството при GSTK1-1 и дефицитни на адипонектин миши фенотипове, сега проучихме ефекта на дефицита на GSTK1-1 върху мултимеризацията на адипонектин и медиираните от адипонектин функции в мишките на GstK1 -/-.

Материали и методи

Описано е генерирането на GstK1 -/- мишки, използвани в това проучване. В това проучване са използвани петнадесет мъжки мишки GstK1 -/- и техният контрол от див тип на възраст от 12 до 20 седмици. Диета с високо съдържание на мазнини (Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Австралия) се прилага ad libitum в продължение на 8 седмици и се състои от 23% мазнини, 0,19% холестерол с 43% обща смилаема енергия, получена от липиди.

Тестове за толерантност към глюкоза

Мишките бяха на гладно 6 часа преди определяне на кръвната захар с помощта на глюкометър Optium Xceed (Abbot Diagnostics, VIC, Австралия). След това мишките се инжектират интраперитонеално с 2 g/kg D-глюкоза (Sigma Aldrich, Castle Hill, NSW, Австралия) и кръвната глюкоза се измерва на всеки 15 минути в продължение на 1 час.

HMW-специфични и HMW-специфични адипонектинови имуноанализи (ELISA)

Общите (R и D системи, Минеаполис, MN, САЩ) и специфичните за HMW (Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA) серумни нива на адипонектин бяха измерени с помощта на търговски ELISA комплекти в съответствие с инструкциите на доставчика.

Уестърн петно

За серумен адипонектин, 2,5 μl разреждане на 1: 1500 миши серум беше разделено на една лента върху нередуциращ, денатуриращ 4-20% SDS-полиакриламиден гел (Biorad, Hercules, CA, USA). За напълно активирана фосфо-5-AMP протеинкиназа (AMPK), черният дроб се хомогенизира в T-PER буфер (Thermo Scientific, Рокфорд, Илинойс, САЩ), допълнен с протеаза (Roche, Castle Hill, NSW, Австралия) и фосфатазни инхибитори ( Merck, Darmstadt)., Германия). Количествените белтъци бяха използвани с помощта на BCA комплект за анализ на протеин (Thermo Scientific) и 20 μg протеин, разделени на лента. Геловете се попиват върху мембраните на Immobilon PVDF (Millipore, Billerica, МА, САЩ) и се блокират за една нощ при 4 ° C в 2% BSA в Tris-буфериран физиологичен разтвор (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5) мембрани са изследвани с анти-адипонектинови антитела (Millipore), анти-тотални или анти-фосфо Thr172-AMPK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Мембраните бяха изследвани с конюгирани с HRP вторични антитела (Dako, Produktionsvej, Дания), разработени с помощта на усилени хемилуминесцентни реагенти (GE Healthcare Bio-Sciences, Rydalmere, NSW, Австралия) и изложени на рентгенов филм.

резултатът

Първоначално използвахме Western blot, за да потвърдим, че GSTK1-1 се експресира в бялата мастна тъкан на нормални мишки и не присъства в Gstkl -/- мишки (Фигура 1а).

( а ) Анти-GSTK1 Western blot върху гонадна бяла мастна тъкан при мишки GSTK1 +/+ и GSTK1-/-. ( б ) Общ серумен адипонектин, измерен чрез ELISA в GSTK1 +/+ и GSTK1 -/- мишки, хранени с нормална диета. N = 15 за двете групи. ( ° С ) HMW адипонектинов серум, измерен чрез ELISA в GSTK1 +/+ и GSTK1 -/- мишки, хранени или с нормална чау, или с диета с високо съдържание на мазнини. N = 5 за всички групи. ( д ) Откриване на адипонектинов серумен мултимер чрез SDS-полиакриламиден гел нередуцираща електрофореза, последвано от Western blot в GSTK1 +/+ и GSTK1-/- мишки. ( д, е ) Интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза при GSTK1 +/+ и GSTK1 -/- мишки, хранени с нормална чау ( д ) или диета с високо съдържание на мазнини ( е ). N = 6 за всички групи. ( ж ) Чернодробни нива на фосфо- и общите нива на AMPK, открити от Western blot. За всички петна е показана представителна двойка на една от четирите възрастови и полови GSTK1 +/+/GSTK1-/- мишки.

Изображение в пълен размер

За да изследваме разпределението на размера на адипонектин в серума, използвахме нередуцираща SDS-полиакриламидна гел електрофореза за фракциониране на серума от мишки с високо съдържание на мазнини, хранени в продължение на 8 седмици, и характеризираме адипонектинови мултимери чрез Western blots. Открихме подобно разпределение на мултимери с ниско молекулно тегло, средно молекулно тегло и HMW както при мишки от див тип, така и при мишки GstK1 -/- (Фигура 1d).

Тъй като нивата на адипонектин корелират с подобрения глюкозен толеранс, ние подложихме мишки от див тип и GstK1 -/-, хранени или с нормална диета (Фигура 1д), или с диета с високо съдържание на мазнини (Фигура 1е), на интраперитонеален тест за толеранс към глюкоза. Не са наблюдавани разлики в концентрациите на глюкоза в кръвта на гладно или в клирънса на глюкозата в кръвта между мишки от див тип и GstK1-/-.

Адипонектинът има благоприятен ефект върху инсулиновата чувствителност чрез фосфорилиране и активиране на AMPK. В нашето проучване обаче не са открити разлики в нивата на чернодробен фосфо-AMPK между мишки от див тип и мишки GstK1 -/-, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (Фигура 1g).

дискусия

Адипонектинът е много интересен поради своята критична роля за поддържане на инсулиновата чувствителност и неговите противовъзпалителни ефекти. Пост-транслационната мултимеризация на адипонектин до видове с ниско молекулно тегло, средно молекулно тегло и HMW е от особено значение, тъй като полезните метаболитни ефекти на адипонектина се дължат до голяма степен на формата HMW. Тъй като GSTK1-1 участва в пост-транслационната олигомеризация на адипонектин и неговата експресия в мастната тъкан е в отрицателна корелация с метаболитния синдром при мишки и хора, 9 предполага, че мишките с дефицит на GSTK1-1 могат да страдат от голям дефицит на адипонектинови олигомери и да имат фенотип, който отразява аномалии в инсулиновата чувствителност. В предишно проучване установихме, че мишките GstK1 -/- имат малко по-ниски серумни нива на адипонектин (P = 0,047), но тази разлика не е налице в настоящото проучване с по-голям брой мишки. Изненадващо, настоящите проучвания не разкриват промяна в общия или HMW серумен адипонектин или модел на мултимеризация. В допълнение, не открихме доказателства за намален глюкозен толеранс или нива на фосфо-AMPK, фенотипове, които биха могли да бъдат прогнозирани, ако Gstk1 -/- мишките показват значителен HMW дефицит на адипонектин.

Няколко протеини, включително ендоплазмен ретикулум-свързан протеин 44 (ERp44) и ендоплазмен оксидоредуктин-1-подобен протеин (Ero1-Lα), са замесени в адипонектиновата мултимеризация, трансфер и секреция (за преглед вж. Wang et al. 1) . Възможно е тези или други молекулярни шаперонови протеини също да насърчават дисулфидно свързана адипонектинова мултимеризация и да осигуряват алтернативни компенсаторни пътища за олигомеризация в отсъствието на GSTK1-1.

Приликите в бъбречната патология (албуминурия и аномалии на подоцитния процес), наблюдавани при мишки GSTK1-1-15 и дефицитни на адипонектин 16 мишки, са любопитни, като се има предвид, че дефицитът на дефицит на GSTK1-1 се дължи на мултимеризация на адипонектин. Тъй като обаче някои функции на адипонектин изглеждат специфични за олигомерите и тъй като разпределението на размера на олигомерите в средното молекулно тегло и категориите HMW е широко (вж. Фигура 1г), възможно е GSTK1-1 да е отговорен за формирането на специфично подмножество на олигомери, които не се отличават с това, което използвахме в това проучване.

Тези данни предполагат, че всеки опит за фармакологично регулиране на молекулярните шаперони, които допринасят за мултимеризация на адипонектин, може да не доведе до нетно увеличение на адипонектин HMW. Следователно, липсата на ефект на дефицита на GSTK1-1 върху мултимеризацията на адипонектин, докладвана в това проучване, има отрицателно въздействие върху предположението, че GSTK1-1 е цел за терапевтична намеса при инсулинова резистентност и свързани с това разстройства. 9