Резюме:

Изчерпването на Т-клетките на костния мозък чрез противотоково центробежно елуиране намалява риска от заболяване присадка срещу гостоприемник (GVHD). Въпреки това, поради високите нива на неуспех на присадката и рецидив, само елуирането не подобрява оцеляването. Проведохме клинично проучване фаза II при 54 педиатрични пациенти, за да определим дали подборът на CD34 + за спасяване на плюрипотентни стволови клетки от дребноклетъчната фракция подобрява адхезията. Обработените присадки съдържат средно 5,5 х 10 7 клетки/kg IBW, 4,7 x 106 CD34 + клетки/kg IBW и 6,3 x 10 5 CD 3+ клетки/kg IBW. Пациентите са постигнали ANC> 500 при медиана от 16 дни и брой тромбоцити> 20 000 при медиана от 28 дни. Честотата на клинично значимите GVHD е 19%. Общо 10 пациенти, включени в това проучване, са имали неуспех на присадката, като осем от 14 пациенти са трансплантирани по доброкачествени показания, които не могат да бъдат стабилно установени. Неуспехът на присадката е статистически значимо свързан с недиагностицирана диагноза (Р 3, 4, 5, този подход носи потенциален риск от повишена заболеваемост и смъртност, свързана с трансплантацията).

Противотоковото центробежно елуиране (CCE) разделя клетките на костния мозък въз основа на седиментационните свойства и е доказано, че осигурява почти пълно възстановяване на клетките в няколко фракции по размер. 6 Лимфоцитите се разделят на малки и средни клетъчни фракции, докато едроклетъчната фракция съдържа по-голямата част от CFU-GM в колекцията на костния мозък и е 100 до 1000 пъти изчерпана от лимфоцитите. Ранните проучвания в тази институция показват, че когато една голяма клетъчна фракция се използва като единствен присаден компонент, честотата на клинично значими GVHD може да бъде значително намалена. Честотата на неуспех на присадката обаче се е увеличила до 10%. Пациентите, които са получавали по-ниски дози лимфоцити (5 х 105 срещу 1 х 106 лимфоцити/кг идеално телесно тегло), са имали забавено придържане на гранулоцити и тромбоцити и висока честота на смесен хемопоетичен химеризъм, определен чрез RFLP анализ на костния мозък. Въпреки че други изследователи съобщават за степен на неуспех на присадката само с 5% само с CCE, 10 този процент е по-висок от този, наблюдаван при неманипулирана трансплантация на костен мозък. 11, 12

През 1990 г. Jones et al. 13 показа на модел на мишка, че за успешното присаждане са необходими два класа клетки: ангажирани прародители, които осигуряват първоначални, но неподдържани присадки, и плюрипотентни хематологични стволови клетки (PHSC), които осигуряват забавено и трайно присаждане. Тези PHSCs копулират с лимфоцити във фракциите на елуирането на малките клетки и по този начин се секретират от TCD алотрансплантата. На тази основа е разработено проучване от фаза I, използващо CD34 + селекция, за да се получи PHSC от фракцията на елуирани малки лимфоцити. 14 Спасяването на малки CD34 + клетки може значително да съкрати времето до присаждане, докато ниската честота на тежка GVHD, наблюдавана при стандартно TCD елуиране, се запазва.

След това бяха проведени клинични проучвания фаза II за допълнително изясняване на ролята на изчерпването на Т-клетките, CD34 + костен мозък при съвпадащи братя и сестри и несвързани трансплантации. Резултатите от проучване при възрастни 15, 16 показаха, че както острият, така и хроничният GVHD са значително намалени и че изборът на CD34 + стволови клетки е свързан с бързо присаждане и по-кратки приема в болница. 3.6% честотата на неуспех на присадката е по-висока от тази, наблюдавана при неманипулирани трансплантации на костен мозък, 11, 12, но може да се обясни с известни рискови фактори при четири от пет пациенти. Трима пациенти с ОМЛ са получили кръвопреливане на тромбоцити от донор на костен мозък преди трансплантацията и по този начин са били специално алоимунизирани. Четвъртият пациент е имал 3-годишна история на апластична анемия, която се е развила в миелодиспластичен синдром (MDS). Пети пациент е имал късен неуспех на присадката> 155 дни след BMT при липса на известна инфекция или GVHD и причините за този неуспех са неизвестни.

Техниката на CD34 + елуиране на стволови клетки вече е проучена при педиатрични пациенти, подложени на алогенна BMT, и резултатите от това клинично проучване фаза II са представени тук. Подобно на възрастните, тези пациенти показват значително намаляване на клинично значимата GVHD и времето до трансплантация. Въпреки това, много по-висока честота на неуспех на присадката се наблюдава при тази популация, особено при деца, подложени на BMT при доброкачествени наследствени нарушения.

Материали и методи

Допустимост на пациента

Между 1 януари 1995 г. и 31 август 2000 г. педиатрични пациенти на възраст от 6 месеца до 21 години, които отговарят на специфични диагностични критерии и критерии за допустимост, са включени в един от трите институционални протокола, използващи същото лечение на присадката. Пациентите, включени в тези протоколи за лечение, отговарят на установените критерии за заболяване и допустимост: възраст над 6 месеца; адекватно тестване на белодробната функция (> 75% от предвидената стойност); фракция на изтласкване> 50%, демонстрирана чрез ехокардиограма или MUGA; адекватна чернодробна функция, както е посочено от билирубин 17 метилпреднизолон в доза от 10 mg/kg в дни преди трансплантацията −3, −2 и −1 за елиминиране на остатъчните лимфоцити на гостоприемника; метилпреднизолон в доза 0,5 mg/kg/ден iv от 7 до 14 дни и 1,0 mg/kg/ден iv от 15 до 28 дни; перорален преднизон в доза от 0,8 mg/kg/ден от 29 до 42 ден, в доза от 0,5 mg/kg от 43 до 56 дни, в доза от 0,2 mg/kg/ден от 57 до 71 дни и при доза от 0,2 mg/kg през ден от дни. 72-79. Стероидите са преустановени след 79 дни, когато тестът за стимулиране на ACTH показва ендогенно производство на стероиди.

CCE и CD34 + избор

Клетъчното разделяне чрез CCE е описано по-горе. 18 клетки от костен мозък Buffy mantle бяха приготвени на система за афереза ​​COBE Spectra, създадена за обработка на костен мозък (COBE BCT, Lakewood, CO, USA). След това клетки, съдържащи 96% от събраните мононуклеарни клетки, бяха поставени в ротор и камера на Beckman JE-10x (Beckman Instruments, Пало Алто, Калифорния, САЩ) при 20 ° C, скорост на потока 50 ml/min и скорост на ротора от 3000 об/мин. Събрани са три фракции: (1) малка клетъчна фракция, съставена от еритроцити и малки лимфоцити; (2) фракция на средните клетки, съставена от големи лимфоцити, гранулоцити и моноцити; и (3) голяма роторна фракция, съставена от гранулоцити, моноцити, бласти и 11 След елуиране, насищащата фракция и малките и средни фракции се обединяват и инкубират с мишето анти-CD34 антитяло. След това клетките се концентрират, измиват и ресуспендират и CD34 + клетки се събират, използвайки автоматизиран концентратор на стволови клетки Ceprate SC (Cellpro, Bothell, WA, USA). Чистотата на CD34 + клетките беше проверена чрез поточна цитометрия, използвайки конюгирано с фикоеритрин моноклонално антитяло към CD34 (HPCA-2) и CD-3 и конюгирано с флуоресцеин изотиоцианат моноклонално антитяло, разпознаващо CD45 (Becton Dickinson, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) .,

Оценка на присадката на донора

Първоначалното присаждане се определя чрез ежедневна оценка на хематологичните параметри и изследване на костния мозък, ако е продиктувано от клиничен курс. Денят на присаждане на неутрофили се определя като първия от трите последователни дни с ANC> 500. Присаждането на тромбоцити се определя като първия ден с брой тромбоцити> 20 000 без преливане на тромбоцити през предходните 7 дни. Трайността на присадката се оценява в дни +30, +60, +90, +180 и 1 и 2 години след трансплантацията. Анализът на химеризацията се извършва с XY FISH (донор, който не съответства по полов път) или с анализ на RFLP/ДНК сонда (донор от същия пол). Присаждането се определя като възстановяване в рамките на 30 дни с> 95% донорен химеризъм. Всички пациенти, които не отговарят на този критерий, са класифицирани като пациенти с неуспешна присадка. Вторичната недостатъчност на присадката се определя като загуба или трайно намаляване на донорния химеризъм след достигане на първична присадка.

Статистически методи

Броят на клетките е приблизително нормално разпределен след логаритмична трансформация. Следователно са дадени средно геометрични номера на клетките и броят на трансформирани в логаритми клетки е използван във всички статистически анализи. Времената на събитията се измерват от датата на BMT при пациенти, цензурирани към момента на смъртта или от датата на последното проследяване. Разпределението на времето на събитието се изчислява, като се използва метод за ограничаване на продуктите на Kaplan и Meier 19 и доверителни интервали, определени с помощта на формулата 20 на Greenwood. Датата и етапът на GVHD са определени от лекуващия екип или GVHD екип и са записани съгласно публикуваните критерии. 21 Пациентите са били оценени за остра GVHD, ако са оцелели след ден 30 след BMT или са развили GVHD преди ден 30. Пациентите, които са оцелели 90 дни след BMT, са оценени за хронична GVHD. Точният тест на Fisher и тестовете за оценка на Wilcoxon бяха използвани за определяне на хетерогенност. За сравнение на двете средства е използван t-тест на Student. Анализът се извършва с помощта на статистически софтуер STATA.

резултатът

Клинични характеристики

Между януари 1995 г. и август 2000 г. 79 педиатрични пациенти са подложени на първоначална алогенна BMT в Детския център на Джон Хопкинс. От тези 79 пациенти 58 са записани в един от трите институционални протокола, като се използват идентични методи за избор на TCD и CD34 + стволови клетки. Четирима от записаните пациенти в крайна сметка са получили неекспонирани присадки поради неадекватен брой клетки (

получаващи

Връзка между времето на присаждане и клетъчната доза. а ) корелация между общата доза на едноядрени клетки и възстановяването на тромбоцитите; ( б ) корелация между CD34 + клетъчна доза и възстановяване на тромбоцитите; ( ° С ) корелация между CD3 + клетъчна доза и възстановяване на тромбоцитите; ( д ) корелация между общата доза мононуклеарни клетки и регенерацията на неутрофили; ( д ) корелация между CD34 + клетъчна доза и регенерация на неутрофили; ( е ) Корелация между CD3 + клетъчна доза и регенерация на неутрофили.

Изображение в пълен размер

да хвана

Използването на елутрирани алотрансплантати, подсилени от селекция на CD34 + при тази популация пациенти е довело до средно присаждане на неутрофили (ANC> 500) на 16 дни (95% CI: 15-17 дни) и адхезия на тромбоцитите над 20 000 на 28 дни (95% CI: 22, 5–32 дни). Педиатричните пациенти, получаващи неконтролирани присадки през този период от време, са имали средно време до възстановяване на неутрофилите от 19 дни (95% CI: 17-21,5) и средно време до възстановяване на тромбоцитите 24,5 дни (95% CI: 21-28).). Времето за възстановяване на неутрофилите беше статистически значително по-бързо при получатели на елуирани трансплантати (P = 0,009), но няма статистически значима разлика в скоростта на възстановяване на тромбоцитите (P = 0,37). Няма връзка между времето за трансплантация и клетъчната доза (Фигура 1).

Неуспешно подаване

От 54-те педиатрични пациенти, получаващи елутрирани, разширени CD34 + алографти, 10 деца (18,5%) са имали неуспех на присадката. Характеристиките на присадката при пациенти с неуспех на присадката са подробно описани в Таблица 3. Нито едно от децата, лекувани с нетретиран мозък през този период, не е показало неуспех на присадката. Неуспехът на присадката е статистически значимо свързан с недиагностицираща изходна диагноза (P 15 съобщава, че това усложнение е преодоляно до голяма степен чрез усилване на алотрансплантата от стволови клетки CD34 +. От 110 възрастни пациенти, лекувани в неговото проучване с идентични трансплантации на братя и сестри и присадка, подобна на присадка само петима пациенти (4,5%) са имали неуспех на присадката, а при четири от петима пациенти припадъкът на присадката се обяснява с известен рисков фактор, включително апластична анемия, обширни кръвопреливания преди трансплантация или предишна сенсибилизация към антигени за хистосъвместимост на донорите. пациенти.

От десетте пациенти с педиатрична недостатъчност на присадката, докладвани тук, осем са претърпели BMT за доброкачествени заболявания. Седем случая на ранен неуспех на присадката не могат да бъдат обяснени с недостатъчен брой клетки в присадката. Средният брой мононуклеарни клетки в тази подгрупа пациенти е по-висок, отколкото в цялата група елуирани присадки (6.38x107 срещу 5.5x107), а най-ниската доза клетки е 2.95 × 107 мононуклеарни клетки/kg IBW. По същия начин средният брой CD34 + и средният брой CD3 + клетки са били по-високи при пациенти с неуспешна присадка, отколкото в цялата проучвана група. Нито една от неуспешните присадки не е обяснена с предишна сенсибилизация на HLA. Въпреки че и двамата пациенти с таласемия са получили множество трансфузии на червени кръвни клетки преди трансплантацията, нито един от донорите на костен мозък. В допълнение, никой от четирите пациенти никога не е получил трансфузия на тромбоцити преди BMT.

Всички 10 пациенти, които са претърпели неуспех на присадката, са получили профилактика на GVHD с CSA, а четирима пациенти с несвързан или несъгласуван семеен донор на HLA са получили профилактични стероиди. Терапевтичните нива на CSA се поддържат при всички пациенти. Един пациент е развил клинично значима GVHD. Дисбалансът на алореактивност присаждане срещу присадка би предразположил към отхвърляне, докато GVHD би благоприятствал присаждане на донор. Този пациент е имал само лимфоиден химеризъм и спасителната терапия на рефрактерни GVHD е била силно лимфотоксична.

В нашето проучване шест от 12 двойки донори - реципиенти с пациенти от мъжки пол и жени - са имали неуспех в присаждането. Връзката между несъответствието между половете и неприсаждането се доближава до статистическа значимост със стойност на Р 0,07. Други автори установяват връзка между неуспех на присадката и несъответствие между половете при трансплантации на TCD, 23, 24, но асоциацията е по-изразена при пациенти с донори от мъжки пол. По същия начин, BMT проучване за тежка апластична анемия, проведено в тази институция, установява повишен риск от отхвърляне, когато пациентите получават костен мозък от мъже донори. 25 Доклад на Европейската група за трансплантация на кръв и костен мозък при несвързани донори за транскрипции на анемия на Fanconi 26 установява по-висока честота на първична недостатъчност на присадката при жени донори, но тази констатация се дължи на ниския брой женски костни присадъчни клетки. Това не беше така при нашите пациенти и донори с неуспех при присаждане.

Вирусната инфекция може да бъде свързана с неуспех на присадката и един пациент с SCID е документирал грип А от храчки, получени 1 ден след трансплантацията. Двама от тримата пациенти, които са претърпели предварителна трансплантация с високи дози кондициониране на цитоксан, са развили BK вирус-положителна хематурия, но няма връзка между BK вирусна инфекция и неуспех на присадката. Ранен CMV антиген е открит при пациент с ALD 1 месец преди отхвърлянето на присадката и е бил адекватно лекуван с ганцикловир без развитие на цитопении или CMV заболяване.

Неуспехът на присадката при таласемия е добре описан риск, като честотата варира от 7% при пациенти от клас 1 и клас 2 до 22% при пациенти от клас 3. 27, 28, 29, 30 Въпреки че броят на пациентите с таласемия, подложени на BMT в нашата серия, е твърде малък, за да се постигне статистическа значимост, честотата на неуспех на присадката при трима от четирима пациенти е клинично важна и много по-висока, отколкото се смяташе досега в настоящата литература . Освен това и трите пациенти с таласемия, които са претърпели неуспех на присадката, са класифицирани в клас 1 и следователно са имали очакван риск от неуспех на присадката само 7%. Интересното е, че един пациент от нашата поредица, който е постигнал постоянно придържане, е назначен за клас 3.

Използвайки CCE за изчерпване на трансплантанта на Т-клетъчен мозък и поточна цитометрия за спасяване на CD34 + стволови клетки от богатата на лимфоцити фракция, успяхме да постигнем бързо придържане на костния мозък на донора, като същевременно поддържаме ниски нива на клинично тежка GVHD. Този метод на манипулация на присадката води до 200-кратно намаляване на Т-клетките в сравнение с реколтата преди обработката и 2-кратно увеличение на CD34 + стволови клетки в сравнение с елуираните роторни фракции. Добавянето на CD34 + стволови клетки към алотрансплантата предотвратява забавената присадка, наблюдавана при единичен елутриран мозък. Нашите пациенти показаха средно време до неутрофили (ANC> 500) и тромбоцити (> 20 000 без трансфузия в продължение на 7 дни) на 16 дни и 25 дни. Тези резултати са подобни на тези, описани от O'Donnell et al 15 при възрастни пациенти, които са претърпели съответни трансплантации на братя и сестри с подобно приготвени алотрансплантати.

Честотата на клинично значима GVHD (19%), наблюдавана в това проучване, е ниска. При пациенти, претърпели несвързани с HLA BMT, честотата на клинично значимо GVHD надвишава 75% при нелекувани присадки и профилактика на CSA/метотрексат. Въпреки че известна степен на GVHD е желателна поради свързания с нея ефект на присадка срещу левкемия, точното титриране на GVHD е трудно. Следователно GVHD остава основна причина за заболеваемост и смъртност при несвързани трансплантации. В тази институция използването на обикновен TCD намалява честотата на клинично значимите GVHD под 25%. Въпреки това, простият TCD е свързан с по-висока честота (10%) на неуспех на присадката и следователно не води до цялостно подобрение на преживяемостта. Едновременната употреба на CD34 + увеличаване с елуиране ни позволи да постигнем бързо и трайно придържане, като същевременно поддържаме ниски нива на тежка GVHD. В паралелно проучване при възрастни пациенти, претърпели подходяща трансплантация на братя и сестри, O'Donnell et al. Те съобщават само за 11% от клинично значимите GVHD. Тези резултати са в съответствие с 19% процент, наблюдаван при педиатрични пациенти, подложени на свързана и несвързана трансплантация. И двата опита представляват значително подобрение спрямо неманипулираната присадка на BMT.

В това проучване на 54 педиатрични пациенти, TCD с увеличение на CD34 + доведе до бързо придържане и ниски нива на клинично значимо GVHD при пациенти с хематологични злокачествени заболявания. Въпреки това, при пациенти с доброкачествени заболявания, подгрупа от пациенти, при които профилактиката на GVHD е най-желана, тъй като няма свързана полза от присадката спрямо левкемия, тази техника за манипулация на присадката е свързана със значителен риск от неуспех на присадката. Възможните обяснения за това откритие включват по-непокътнат имунитет в сравнение с тежко лекувани пациенти с левкемия и алоимунизация от множество трансфузии на червени кръвни клетки. При деца с доброкачествени заболявания ще е необходимо да се намали рискът от отхвърляне на присадката чрез увеличаване на имунната аблация с подготвителен режим и/или подобряване на имунната супресия след трансплантацията. Целта на тези модификации е да се поддържат предимствата на CD34 + TCD за увеличаване, включително бързо време за присаждане и ниска честота на GVHD, като същевременно се намалява рискът от повреда на присадката.