елементи
абстрактно
Изолираният митохондриален комплекс IV (цитохром с оксидаза) е важна причина за митохондриална болест при деца и възрастни. Той е генетично хетерогенен, тъй като както кодираните с mtDNA, така и кодираните от ядрени клетки генни продукти допринасят за структурните компоненти и факторите за сглобяване. Патогенните варианти в тези протеини са свързани с клинична вариабилност, варираща от засягане на изолирани органи до представяне на мултисистемни заболявания. Описани са дефекти в повече от 10 комплексни IV комплексни фактора, включително скорошна мутация на ливанския основател в PET100 при пациенти със синдром на Leigh. Представяме клинично и молекулярно изследване на пациент с фатално, новородено начало на изолиран дефицит на комплекс IV, свързан с мултиорганно участие, който е роден в семейство на сродни британски азиатски семейства от първото семейство. Последователността на екзомомите разкри хомозиготен вариант на отрязване (c.142C> T, p. (Gln48 *)) в гена PET100, което води до пълна загуба на ензимната активност и холокомплексния сбор. Нашият доклад потвърждава мутацията PET100 като важна причина за изолиран дефицит на комплекс IV извън ливанската популация, като по този начин разширява фенотипния спектър, свързан с аномалии в този ген.
Митохондриалното окислително фосфорилиране (OXPHOS) е основният път за производство на аденозин трифосфат (ATP) в еукариотните клетки. Тази система OXPHOS съдържа пет трансмембранни комплекса (I-V), които се състоят от
Тук съобщаваме за прилагането на цялостна екзома секвениране за изясняване на основата на изолиран дефицит на COX при педиатричен пациент с тежко и фатално новородено представяне на митохондриална болест поради хомозиготен вариант на съкращаване в гена PET100. Предишни проучвания върху дрожди са идентифицирали гена PET100 като фактор за биогенезата на COX, 21, 22, 23, а по-скорошна ливанска мутация в основателя на PET100 е описана при 10 индивида със синдром на Leigh. Фибробластите и скелетните мускули при нашия пациент показват нарушена активност на комплекс IV, свързана с дълбоко разстройство в сглобяването на COX и намалени нива в стационарно състояние на комплекс IV протеини. Тези данни предоставят допълнителни доказателства, че PET100 е съществен фактор, участващ в узряването и сглобяването на комплекс IV.
Предмети и методи
Пациент 1
Нашият пациент (ID 73387) е дете, родено в императорския курорт в 34-седмична бременност, в семейството на британски пакистански брат на първия братовчед. Антенаталните прегледи показват, че тя е малка в бременността си, с тегло 1, 19 кг при раждане с обиколка на главата 26, 7 см, доста под 0,4 сентила. Индукцията на труда поради забавяне на растежа настъпи, но не успя, което доведе до спешно цезарово сечение. Резултатът по Apgar беше 4 за 1 минута, 7 за 5 минути и 9 за 10 минути. Приета е в отделението за интензивно лечение за новородени за непрекъсната вентилация на дихателните пътища с положително налягане.
Молекулярна генетика
Общата геномна ДНК е получена с помощта на стандартни методи и кодиращата област плюс границите на интрон и екзон на няколко COX комплекта (SURF1, SCO1, SCO2, COX10, COX14, COX15, COA5, LRPPRC, TACO1, FAM37A) и структурни (NDUFA4) гени са усилени с използване на специфични за локуса праймери (секвенции се предлагат при поискване), секвенирани с помощта на комплекта BigDye v3.1 и капилярна електрофореза на платформата за секвениране на флуоресценция ABI3130xl (Life Technologies, Warrington, UK).
Извършено е секвениране на цялата екзома за определяне на генетичната основа за представяне на митохондриалната болест на детето, както е описано по-горе. Комплектът SureSelect Human All Exon 50 Mb V5 (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ) беше използван за обогатяване на кодиращите ДНК фрагменти и секвенирането беше извършено на система HiSeq2000 (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). BWA (версия 0.5.8) се използва за привеждане на четенето в съответствие с човешкия референтен комплект (hg19) и вариантите с единичен нуклеотид (SNV), а малки вмъквания и заличавания са открити с помощта на SAMtools (версия 0.1.7). Средното покритие е 128 пъти и> 97% от целевата зона е покрито поне 20 пъти, което позволява повиквания с висока надеждност. Подробна статистика за последователността е показана в Таблица 1.
Маса в пълен размер
Лизис на клетки и Western blotting
Култивираните фибробласти се събират и лизират в 50 mM Tris-HCl рН 7,5, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM фенилметансулфонил флуорид (PMSF), 1% Nonidet P-40 (v/v) и 1x инхибитор без EDTA инхибитор. протеази (Pierce, Rockford, IL, USA). Протеиновите лизати (40 μg) се разделят по размер върху 12% гелове, използвайки натриев додецил сулфат - полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE) и електрофоретично се прехвърлят в PVDF мембрана (Immobilon-P, Millipore Corporation, Darmstadt, Германия). Имуноблотинг се извършва с използване на първични и HRP-конюгирани вторични антитела.
Митохондриална подготовка и синя естествена електрофореза
Култивираните фибробласти бяха събрани, ресуспендирани в хомогенизационен буфер (НВ) (0.6 М манитол, 1 тМ етиленгликол тетраоцетна киселина, 10 тМ Трис-HCl рН 7, 4.1 тМ PMSF и 0.1% (об/об). Говежди серумен албумин (BSA )) и подложен на хомогенизационен преход 3 х 15 с помощта на тефлонов стъклен хомогенизатор Dounce при 4 ° С. Използвано е стандартно диференциално центрофугиране (400 g за 10 минути) за отстраняване на ядрата и клетъчните остатъци и митохондриите накрая се гранулират при 11 ° С. 000 g за 10 минути при 4 ° C. Митохондриите се промиват в НВ без BSA и крайната пелета се разтваря в n-додецил-β-D-малтозид (DDM) (Sigma) при 2 mg/mg протеин върху лед за 20 минути. След центрофугиране (100 000 g за 15 минути при 4 ° С), супернатантата се събира и се добавя Coomassie Blue G-250 (AMS Biotechnology (Europe) Ltd, Abingdon, UK). Митохондриалните мембранни протеини (50 μg) бяха заредени в NativePAGE 4-16% BisTris гел (Life Technologies), електрофоретично разделени и прехвърлени в PVDF мембрана. След това мембраната беше имуноблотирана с антитела срещу OXPHOS комплекси.
имуноблотинг
Следните първични антитела бяха използвани за имуноблотинг: NDUFA9 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, A21344), NDUFB8 (Abcam, Cambridge, UK, ab110242), SDHA (MitoSciences, Eugene, OR, USA, MS204), UQCRC2 (Abcam, ab14745), COX1 (Abcam, ab14705) и COX2 (молекулярни сонди, A6404), ATP5A (Abcam, ab14748), ATPB (Abcam, ab14730) и TOM20 (Санта Круз, Хайделберг, Германия, sc11415). Използвани са HRP-конюгирани анти-миши или заешки вторични антитела (P0260 и P0399; Dako, Glostrup, Дания). Комплектът за хемилуминесценция ECL Prime Kit (Amersham, Little Chalfont, Великобритания) и системата за изображения ChemiDocMP (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Великобритания) бяха използвани за откриване на сигнал, а софтуерът Image lab 4.0.1 (Bio-Rad) за анализ.
резултатът
Мускулна хистохимия и анализ на дихателната верига
Анализът на мускулна биопсия на пациента показва тежка и глобална загуба на COX хистохимична активност през цялото време (не е показано), потвърдено от спектрофотометричен тест на активността на дихателната верига, който показва тежък и изолиран IV дефицит на комплекс в мускулни хомогенати (Фигура 1а) ). Това наблюдение е потвърдено при пациенти с фибробласти, при които активността на комплекс IV е значително намалена (Фигура 1b).
Идентифициране на дефицита на изолираната митохондриална дихателна верига от комплекс IV в мускулите и фибробластите и анализ на варианта PET100. Оценка на активността на отделните ензими на дихателната верига в мускулите ( а ) и фибробласти ( б ) идентифицира тежък OXPHOS комплекс, засягащ комплекс IV при изолиране на пациента (сини ленти) в сравнение с контролите (червени ленти); средните ензимни активности, показани за контрол на мускулите (n = 25) и контрол на фибробластите (n = 10), са определени като 100%. ( ° С ) Семейно родословие, което потвърждава състоянието на превозвача p. (Gln48 *) при клинично незасегнати родители, докато пробандът е хомозиготен за вариращия вариант.
Изображение в пълен размер
Молекулярно-генетичните изследвания идентифицират нов пресечен вариант на PET100
Мутацията на PET100 води до увреждане на комплекс IV
Допълнително характеризиране на естеството на биохимичния дефект, свързан с варианта PET100, беше проведено при фибробласти на пациента. Равновесните нива на отделните субединици на комплекса OXPHOS и последващото сглобяване в митохондриални комплекси на дихателната верига бяха анализирани чрез синьо-естествен PAGE (BN-PAGE) и SDS-PAGE.
Анализът на стационарните нива на компонентите на OXPHOS комплекс потвърждава значително намаляване на COXI и COXII при пациенти в сравнение с контролните фибробласти (Фигура 2а). Не са открити съществени промени в никое от нивата на стабилно състояние на всички анализирани комплекси (I, II, III и V), въпреки че нивата на комплекс III се увеличават в съответствие с ензима на дихателната верига.
1,6 пъти въз основа на денситометричен анализ (Фигура 2а). Подобно наблюдение е направено по-рано при пациенти с патогенни варианти в друг ген от COX комплекта, SURF1. 28 TOM20 беше използван като митохондриален уводен маркер и потвърди същото зареждане на контролни и митохондриални протеини на пациента.
Равновесни нива на OXPHOS компоненти и комплекси. ( а ) Клетъчният лизат от контролни (С1 и С2) и пациентски (Р) фибробласти (40 μg) се анализира чрез SDS-PAGE (12%) и имуноблотинг. Специфичните за субединицата антитела бяха използвани срещу CI (NDUFA9, NDUFB8), CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1, COX2) и CV (ATPB). Външният маркер на митохондриалната мембрана, TOM20, беше използван като контрол на натоварването. ( б ) Митохондриалните протеини (50 μg), изолирани от пациенти (P) и контролни (C1) фибробласти се анализират чрез едномерни BN-PAGE (4 до 16% градиент), като се използват специфични за субединицата антитела, както е посочено (CI (NDUFA9)). CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1) и CV (ATP5A)) за оценка на сглобяването на отделни OXPHOS комплекси. Комплекс II (SDHA) беше използван като контрол на натоварването.
Изображение в пълен размер
В съответствие с това намаляване на стационарните нива на CIV протеин и биохимичните измервания на активността на комплекса на дихателната верига (Фигура 1b), BN-PAGE анализът разкрива значително намалени количества комплекс IV комплекс в клетките на пациентите в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта (Фигура 2b). Тази загуба на комплекса OXPHOS е специфична, тъй като профилът на сглобяване на комплекси I, II, III и V е нормален.
Тези данни показват, че хомозиготният вариант p100 (Gln48 *) PET100 води до специфична и тежка загуба на COX субединици и напълно сглобен IV комплекс.
дискусия
Въпреки че изолираният дефицит на COX се счита за едно от най-често срещаните нарушения на енергийния метаболизъм, той има разнообразна генетична етиология, която отразява сложния характер на биогенезата и сглобяването на mtDNA компоненти и ядрено кодирани компоненти в зрял холоензим; процес, улеснен от много шаперонови протеини. Патогенните варианти са описани в редица фактори за сглобяване, необходими за образуването на функционален COX ензим. 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Основна мутация във високо запазения COX сборен фактор PET100 наскоро беше идентифицирана при 10 ливански индивида с изолиран дефицит на COX, които имат синдром на Leigh и гърчове. 24
Тук докладваме, че нов вариант на пресечен PET100 причинява фатална инфантилна лактатна ацидоза и изолиран дефицит на COX при бебе, родено от роден британски пакистански родител. Вариантът на патогенните глупости (c.142C> T, p. (Gln48 *)) в гена PET100 е идентифициран чрез секвениране на цялата екзома, което води до нарушена ензимна активност на комплекс IV и ненормално събиране на COX. Нашите резултати са в съответствие с публикувани по-рано данни, предполагащи, че PET100 е запазен фактор за биогенеза, участващ в узряването на комплекс IV при хора 24 и дрожди. 21, 22, 23 Хомологът на дрождите PET100 не е от съществено значение за локализацията на COX полипептидите във вътрешната митохондриална мембрана 21, но играе основна роля в по-късните процеси на сглобяване, където улеснява сглобяването на междинните продукти на COX. За разлика от това изглежда, че човешки PET100 е необходим по-рано в процеса на сглобяване на митохондриално кодирани COX субединици. Нашите резултати демонстрират значението на PET100 за функцията на OXPHOS и подкрепят предишни проучвания; 21, 22, 23, 24 обаче се изискват допълнителни проучвания, за да се разбере напълно точната роля на този ензим в узряването на COX холоензима.
Последователността на цялата екзома е бърз и ефективен подход за изясняване на молекулните основи на митохондриалните нарушения на дихателната верига, включително изолиран дефицит на COX. Нашите открития потвърждават PET100 като важен ген за заболяване кандидат при пациенти с изолиран дефицит на COX. Неотдавнашният напредък в секвенирането от следващо поколение даде възможност за бърза и точна диагностика на пациенти с прости митохондриални заболявания в малки семейства, улеснявайки подходящо консултиране и осигуряване на превантивни стратегии като пренатална диагностика и генетично профилиране преди имплантация.