елементи
абстрактно
Кератиноцитите и фибробластите комуникират чрез секрецията на растежни фактори и цитокин 9. По време на зарастването на рани фибробластите в раневото легло секретират кератиноцитен растежен фактор (KGF), който задейства пролиферацията на кератиноцити, което улеснява реепителизацията 10. В допълнение, екзогенната експресия на KGF-1 в ексцизионни рани на генетични модели на мишки с диабет подобри скоростта на зарастване на раните и епителизацията 11. Установено е, че пролиферацията на епителни клетки, индуцирана от 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (TPA) и локалното възпаление са намалени в отсъствието на пролифериращ фибробласт 12. Накратко, фибробластите играят важна роля в секрецията на растежни фактори, необходими за пролиферацията на кератиноцитите по време на процеса на заздравяване на кожната рана.
Клетъчната миграция, адхезия, морфология, секреция на растежен фактор, пролиферация и други критични клетъчни процеси се регулират от актиновия цитоскелет 13. N-WASP (Neural-Wiskott Aldrich Syndrome Syndrome) протеин, който е повсеместно експресиран и е доказано, че е критичен регулатор на актиновото цитоскелетно ремоделиране чрез Arp2/3 комплекс 14. Дефицитът на N-WASP във фибробластите води до намалена адхезия на клетъчна ECM и повишена подвижност на клетките 15. N-WASP регулира образуването на инвадоподия 16 във фибробласти, трансформирани с Src 17, 18 и засяга 19 или зависима от клатрин независима ендоцитоза 20. Освен това е установено, че N-WASP играе критична роля в регулирането на зависимата от РНК полимераза-II транскрипция, обработката на РНК и възстановяването на ДНК чрез взаимодействие с комплекса PSF-NonO 21. Установено е, че експресията на N-WASP е по-ниска в клетките на рака на гърдата 22, докато силно изразена в хепатоцелуларния карцином 23 .
Мишките с дефицит на N-WASP са имали аномалии в образуването на нервна тръба, диференциация на сърцето и мезодерма и са умрели в ембрионален стадий E11.5 24, 25. Условното отхвърляне на експресията на N-WASP в мозъка на мишката води до тежка хидроцефалия и преждевременна постнатална смърт 26. N-WASP също е от решаващо значение за развитието на Т-клетките 27. Условната аблация на експресията на N-WASP в кератиноцитите води до улцерация, алопеция и изразена епидермална хиперпролиферация. Това прекъснато циклиране на космения фоликул се дължи на повишена сигнализация за TGFβ 28 или намалена Wnt 29-зависима транскрипция. .
резултатът
Загубата на експресия на N-WASP в дермални фибробласти причинява епидермална хиперпролиферация при стари мишки
( A ) Геномна PCR анализ на делеция на N-WASP екзон 3 и 4 в дермални фибробластни клетки, изолирани от контролни и N-WASP FKO мишки. ( Б. ) Western blot анализ на експресията на N-WASP на дермални фибробластни клетки от изолирани мишки на възраст 13 седмици. (Забележка: постигнахме повече от 80% чиста популация на фибробласти от нашия метод за изолиране на фибробласти на миша кожа, той също така съдържа малка популация от други клетъчни типове). ( ° С ) H&E оцветени части от гръбната кожа на 13-седмични и 1-годишни мишки. Количествено определяне на епидермалната ( д ) и дермално ( Е. ) дебелина на контрола и N-WASP FKO участъци от кожата на мишката. N-WASP FKO мишките имат повече от два епидермални слоя в сравнение с контролните мишки. ** Представлява стр
( A ) Разпределението на E-кадхерин в контролните и N-WASP FKO мишки е нормално, но N-WASP FKO мишките показват множество слоеве от епидермални клетки. Червено: DAPI ( Б. ) Епидермална пролиферация, измерена чрез PCNA имунооцветяване на вградени в парафин гръбни кожни участъци на 13-седмични и 1-годишни контролни и N-WASP FKO мишки. Синьо: DAPI ( ° С ) Повишен брой PCNA положителни клетки/MF беше идентифициран чрез количествено определяне при N-WASP FKO мишки. * Представлява p FKO мишки. N-WASP FKO мишките показаха повишена експресия на PCNA на кожата в сравнение с контролните мишки.
Изображение в пълен размер
N-WASP FKO мишките нямат бариерна функция за кожата
За да анализираме функцията на кожната бариера, изолирахме част от кожата от контролни и N-WASP FKO мишки и инкубирахме с луцифер в жълто върху епидермиса. След това част от кожата беше анализирана чрез хистологично оцветяване, за да се визуализира присъствието на Луцифер жълто с помощта на флуоресцентна микроскопия. Както при контрола, така и при N-WASP FKO, флуоресцентното багрило е ограничено до външния слой на епидермиса, което показва, че при мишките N-WASP FKO (фиг. 3А) не е имало очевидна грешка във функцията на бариерната кожа на епидермиса. Кератиноцитната диференциация при N-WASP FKO и контролните мишки беше анализирана чрез имунофлуоресцентно оцветяване за ранни и терминални маркери за диференциация (кератин 10, инволюкрин, трансглутаминаза). Не се наблюдават значителни разлики в модела на оцветяване на маркери за диференциация между контролните и N-WASP FKO мишки, но има по-дебел слой на оцветяване на кератин 10, инволукрин и трансглутаминазни клетки. Това предполага, че делецията на N-WASP в дермалните фибробластни клетки не променя диференциацията на епидермалните клетки (Фиг. 3В).
( A ) Малки прясно изолирани кожни участъци бяха анализирани за теста за проникване в жълто на Луцифер. Бариерната функция на пропускливостта не е засегната при N-WASP FKO мишки. ( Б. ) 13-седмична контролна и N-WASP FKO кожа на мишка бяха оцветени с ранни (кератин 10, трансглутаминаза) и терминални (включващи) маркери за диференциация. Не се наблюдават видими разлики в експресията на маркери за диференциация между контролни и N-WASP FKO мишки. Червено: DAPI.
Изображение в пълен размер
TPA-индуциран хиперпролиферативен отговор
За да изследваме реакцията на кожата на стреса, ние третирахме кожата на контролните и N-WASP FKO мишки локално с естер на 12-O-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат (TPA). Еднократно третиране на 6.5 nM/50 μl TPA за 24 часа върху гръбната кожа се очаква да доведе до значително удебеляване на епидермиса както на контролните, така и на N-WASP FKO мишките в сравнение с третирани с носител мишки (фиг. 4А, В) . Хистологичните анализи на третирани с ТРА кожни участъци показват засилен хиперпролиферативен ефект при N-WASP FKO кожа на мишки в сравнение със стандартните субекти. (Фиг. 4А), със съпътстващо увеличаване на броя на PCNA-позитивни пролифериращи кератиноцити в N-WASP FKO кожа на мишка (Фиг. 4С). Не са установени промени в индуцирана от стрес (лекувана с ТРА) кожа на мишка N-WASP FKO в епидермалните клетъчни кръстовища, тъй като локализацията и моделът на Е-кадхерин са сравними с третираната с ТРА третираща кожа на мишка (Фиг. 4D). По този начин, лечението с ТРА води до повишена хиперпролиферация на епидермални клетки при N-WASP FKO мишки в сравнение с контролните мишки.
( A ) Хистологичен анализ на разтворител (ацетон) и TPA (24 часа) на дорзалната кожа на контролни и N-WASP FKO мишки чрез H&E оцветяване. ( Б. ) Количествено определяне на дебелината на епидермиса на дорзални мишки, третирани с ацетон и TPA. Кожата на N-WASP FKO мишки е значително по-дебела от кожата на контролните мишки след третиране с ТРА. ( ° С ) Имунооцветяване на кожата на третирани с ТРА мишки за анализ на PCNA положителни клетки. Кожата на N-WASP FKO мишки показа значително по-голям брой PCNA-положителни епидермални клетки в сравнение с кожата на контролните мишки. ( д ) Анализ на клетъчно-клетъчна връзка чрез оцветяване с Е-кадхерин при третирани с ТРА мишки.
Изображение в пълен размер
Загубата на експресия на N-WASP в дермалните фибробласти води до по-бързо затваряне на раната
Дермалните фибробласти играят важна роля в зарастването на рани и възстановяването на тъканите 30. За да определим ефекта от дефицита на N-WASP в кожни фибробласти върху възстановяването на тъканите, ние извършихме тест за заздравяване на рани на 13 до 15 седмични контролни групи и N-WASP FKO мишки. Мишките бяха подложени на ексцизионни рани с пълна дебелина и наранената област на мишките беше снимана и количествено определена в посочените часови точки (Фиг. 5). N-WASP FKO мишките показаха значително по-бързо затваряне на раната на 2, 5 и 7 дни след нараняване в сравнение с контролните мишки (Фиг. 5А, В). В допълнение, значително намален диаметър на раната (показан със стрелки) се наблюдава на 7-ми ден при N-WASP FKO мишки (Фиг. 5C, D). За да се характеризира ускорения фенотип на заздравяване на рани при N-WASP FKO мишки, PCNA оцветяване се извършва върху кожни секции на 7-ия ден след нараняване. При N-WASP FKO мишки открихме значително по-голям брой PCNA положителни клетки както в дермалния, така и в епидермалния регион в сравнение с контролните мишки (фиг. 5Е). В резултат на това увеличената скорост на пролиферация на кожни/епидермални кожни клетки след нараняване насърчава по-бързото затваряне на раната при N-WASP FKO мишки .
N-WASP FKO мишките имат повишени фибробласти и колаген
Заздравяването на рани е многоетапен процес, включващ възпалителна фаза, пролиферативна фаза и фаза на узряване 32. За да се определи дали разликите в възпалителните отговори могат да допринесат за повишено заздравяване на рани при N-WASP FKO мишки, в гранулационната тъкан е извършено оцветяване на лимфоцити (CD3/CD4) и неутрофили (Ly-6G антиген). Експресията на N-WASP не променя значително способността на увредената тъкан да придобива неутрофили, но умерено увеличава набирането на лимфоцити (Фиг. S4A). В допълнение, при базални условия кожата на контролните и N-WASP FKO мишки има много ниско съдържание на имунни клетки (данните не са показани). Основната характеристика на слабо зарастващите рани е постоянната възпалителна реакция на мястото на нараняване 33. Въпреки лекото увеличаване на инфилтрацията на имунни клетки в раните на N-WASP FKO мишки, раната се затваря по-бързо, което предполага, че възпалението вероятно няма да бъде основен фактор за по-бързото зарастване на рани при N-WASP FKO мишки.
Изображение в пълен размер
TGFβ сигнализирането се увеличава в N-WASP FKO кожата на мишката
По-високото съдържание на колаген в гранулиращата тъкан на N-WASP FKO мишки показва възможността за увеличаване на секрецията на растежен фактор. В допълнение, кръстосаното взаимодействие между фибробластите и кератиноцитите се осъществява чрез секретирани растежни фактори, които са от съществено значение по време на зарастването на рани. Членовете на семейството на фибробластния растежен фактор (FGF) имат широк митогенен спектър в допълнение към FGF7/KGF, който е специфичен митоген за епителните клетки 38. Анализът на експресията на FGF7 показва увеличение на FGF7 оцветяването в кожата на мишка N-WASP FKO (Фиг. 6Е). В допълнение, леко увеличение на провъзпалителния цитокин IL-1α се наблюдава в кожата на N-WASP FKO мишки (фиг. S4B). Доказано е, че експресията на N-WASP в кератиноцитите регулира сигнализирането на TGFβ 28. Въз основа на тази информация анализирахме сигнализиране на TGFβ, използвайки кожен лизат от контролни мишки и N-WASP FKO мишки. N-WASP FKO мишки експресират по-високи нива на TGFβ-RII, Samd2/3, TAK1 и съответните им активирани форми (p-Samd2/3, pTGFβ-RII) (Фиг. 6F, S4C). Нашите резултати показват, че заличаването на експресията на N-WASP в дермалните фибробласти води до увеличаване на броя на фибробластите, което води до повишено съдържание на колаген и растежен фактор/секреция на цитокини/повишена сигнализация на TGFβ, което води до епидермална хиперпролиферация и по-бързо зарастване на рани при N-WASP F мишки.
дискусия
N-WASP, член на семейството на протеини WASP, регулира полимеризацията на актини чрез регулиране на активността на Arp2/3 комплекс 14. N-WASP се експресира повсеместно и нокаутиращите мишки на N-WASP са ембрионални смъртоносни, което предполага, че N-WASP е основен ген по време на развитието на мишки 24, 25. Установено е, че нокаутните ембриони от N-WASP оцеляват в предишния етап на гаструлация и инициират органогенеза, но умират преди ембрионалния ден 12 с нервни тръби и сърдечни дефекти 25. По този начин, много изследвания са използвали системата lox P-Cre за генериране на кондиционирани N-WASP нокаутиращи мишки, за да изследват ролята на N-WASP в различни тъкани. Условното елиминиране на N-WASP в мускулите от Myf5-cre и MyoD-cre доведе до постнатална смърт 39. По подобен начин, условният нокаут на N-WASP в мозъка с помощта на Nestin-cre също води до постнатална смърт, вероятно причинена от хидроцефалия 26. Две изследователски групи генерират условни нокаутиращи мишки, експресиращи аблация на N-WASP в кератиноцити, използвайки K5-cre 28, 29, но две групи съобщават за контрастиращи роли на N-WASP в кератиноцити. Leferver и сътр. показа, че липсата на експресия на N-WASP в кератиноцитите причинява намален растеж на кератиноцитите, докато Lyubimova et al. показа, че дефицитът на N-WASP води до епидермална хиперпролиферация 28, 29 .
Установихме, че N-WASP във фибробластите играе решаваща роля в адхезията на клетка-ECM 15. За да характеризираме ролята на N-WASP във фибробластите в развитието и поддържането на кожата, създадохме мишки с дефицит на експресия на N-WASP във фибробласти, използвайки Fsp-cre като ръководство. Мишки с N-WASP генотип fl/fl; Fsp-cre, N-WASP FKO са родени след генетиката на Мендел и не показват аномалии в рамките на 1 година от растежа в лабораторията. Не са наблюдавани физически аномалии или намалена сексуална енергия при N-WASP FKO мишки в сравнение с контролите (данните не са показани).
Материали и методи
хистология
Тест за заздравяване на рани
Контролните мишки (n = 16) и мъжките N-WASP FKO мишки (n = 16) на възраст от 13 до 15 седмици бяха анестезирани с кетамин/ксилазин (90 μg/10 μg). Мишките бяха обръснати отзад и почистени с алкохол. За всяка мишка (разделена с най-малко 1 см неповредена кожа) бяха направени две кръгли рани с пълна дебелина (среден размер 10 мм в диаметър) с два форцепса и ножици на гърба, като бяха използвани форцепс и ножица от гръбната страна, без да се повредят долния мускул, както е описано в 62, 63. Раните бяха покрити с оклузивна превръзка (Tegaderm; 3M TM), за да се предотврати инфекция. Рани са заснети в мащаб с помощта на цифров фотоапарат в дни 0, 2, 5 и 7 след нараняване. Площта на раната беше определена с помощта на софтуер imageJ и степента на затваряне на раната беше определена като процент от площта на раната към първоначалния размер на раната. Кожните биопсии за хистологично изследване се извършват от всяка рана на 0 и 7 ден след операцията. За да стане колагенът видим, части от кожата се оцветяват с трихромен массон (кат. №: 25088A-F, Polysciences Inc).
TPA-индуцирана хиперпролиферация
Контролните мишки на възраст от 13 до 15 седмици и N-WASP FKO мишките бяха обръснати 24 часа преди прилагането на TPA (6.5 nM/50 μl в разтворител (ацетон)) върху дорзалната кожа. Мишките се умъртвяват след 24 часа третиране с ТРА; кожата беше изолирана, фиксирана в 4% параформалдехид/PBS при 4 ° C за една нощ и вградена в парафин за хистологични срезове. Секциите се оцветяват с хематоксилин и еозин, PCNA и Е-кадхеринови антитела.
Тест за проникване на луцифер в жълто
За теста за проникване на луцифер в жълто, 1 mM луцифер в жълто (дорзална кожа, епидермална страна) се излива върху 1 см 2 парче кожна тъкан (дорзална кожа, епидермална страна) с предпазни мерки, тъй като багрилото не може да премине през кожната кожа. След инкубация в продължение на 1 час при 37 ° С, кожата се измива обилно с PBS и кожата се нарязва. Криосекциите се оцветяват с DAPI и се анализират чрез флуоресцентна микроскопия.
Тест за свиване на колагенов гел
Експериментът е извършен, както е описано по-горе, с някои модификации 64. N-WASP WT и N-WASP KO миши ембрионални фибробластни клетки се поддържат в DMEM/10% FBS среда. N-WASP WT и N-WASP KO MEFs бяха любезен подарък от лаборатория 25 на Scott B Snapper. Миши ембрионални фибробластни клетки бяха трипсинизирани, преброени и 200 000 клетки бяха добавени към 0,5 mg/ml разтвор на Corning Rat Tala Collagen I (Corning, USA). 1 μM NaOH се добавя незабавно за неутрализиране на сместа. Цялата смес незабавно се прехвърля в плоча с 24 ямки. Гелът се оставя да престои в 37 ° С СО2 инкубатор в продължение на 3 часа. След втвърдяване на гела се добавя пълен DMEM. Отстрани на ямката се отделя твърд колагенов гел. Добавя се предварително разреден TGFβ1, за да се достигне крайна концентрация от 4 ng/ml. Пълната среда се подновява на всеки 24 часа, използвайки пълна DMEM, съдържаща TGFβ1. Изображението е направено и количествено определено с помощта на ImageJ на всеки 24 часа, започвайки от 0 часа. Изображенията са направени чрез поставяне на плоча с 24 ямки, съдържаща гела, върху светлинна кутия с линийка до гела като стандарт за калибриране на размера на пикселите.
Статистически анализ
За статистически анализ на значимостта бяха проведени несдвоени студентски t-тест и p-стойност