абстрактно

Тази работа представя директни доказателства, че генът bcl-2 е транскрипционно регулиран от ядрен фактор -B (NF-κB) и директно свързва сигналния път TNF-α/NF-κB с експресията на Bcl-2 и неговата реакция към оцеляването на човека. клетки от рак на простатата. Следи от DNase I, забавяне на гела и анализ на свръхсместване идентифицират NF-кВ място в bcl-2 β2 промотора. В контекста на минималния промотор, този bcl-2 p2 сайт 1 увеличава транскрипцията 10 пъти в присъствието на p50/p65 експресионни вектори, сравним с нарастването, наблюдавано в NF-κB консенсусното място, докато за пълния p2 промотор, активността на транскрипционния регион в региона се увеличава 6 пъти прекомерно.експресия на NF-kB, ефект, елиминиран чрез мутиране на bcl-2 p2 място 1. Експресията на Bcl-2 е свързана с хормоноустойчив фенотип на напреднал рак на простатата. Тук показахме, че повишаването на нивото на експресия на Bcl-2 в клетъчната линия на човешкия рак на простатата LNCaP, наблюдавано в отговор на отнемането на хормона, се засилва допълнително от лечението с TNF-α и този ефект се отслабва от NF-кВ инхибиторите. В същото време, проучвания на bcl-2 β2 промотори в LNCaP клетки показват 40-кратно увеличение на промоторната активност след стимулация с TNF-α в отсъствието на хормона.

През последните няколко години има все повече доказателства, че сигналните пътища за апоптоза участват в много болестни състояния, включително рак. Ключов играч в апоптозата е семейството на протеини Bcl-2, които могат да бъдат разделени или на анти-апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, A1 и Mcl-1) или на про-апоптоза (Bax, Bid, Bad, Bak, Bic, Bok, Bcl-XS и Hrk) (прегледани в Gross et al., 1999). Много изследвания предполагат, че относителните нива на тези проапоптотични и антиапоптотични протеини в клетката определят дали клетката живее или умира в отговор на апоптотично сигнализиране (Oltvai et al., 1993; Oltvai and Korsmeyer, 1994). Все още не е ясен точният начин, по който Bcl-2 осигурява защита срещу апоптоза; се смята обаче, че пряко или косвено предотвратява освобождаването на цитохром с от митохондриите, което от своя страна предотвратява активирането на Apaf-1 и надолу по течението каспази (Zou et al., 1997).

Маса в пълен размер

Последните проучвания свързват експресията на Bcl-2 с развитието на хормоноустойчив фенотип на напреднал рак на простатата (Colombel et al., 1993; McDonnell et al., 1992; Raffo et al., 1995). Също така сега изглежда, че експресията на Bcl-2 може да защити раковите клетки на простатата от много различни апоптотични стимули, като хормонална аблация, лъчетерапия и химиотерапия, включително лечение с TNFα (Apakama et al., 1996; Chaudhary et al., 1999; Huang et и др., 1998, Mackey et al., 1998). Изследвания, изследващи връзката между Bcl-2 и NF-κB при регулирането на TNF-α-индуцирана апоптоза в раковите клетки на простатата, са установили, че инхибирането на ядрения износ на NF-κB от доминиращи отрицателни IkB мутантни чувствителни клетки към TNF-α-индуцирани апоптоза и екзогенна Bcl-β свръхекспресия 2 ефективно блокира този ефект (Herrmann et al., 1997). В това проучване ние изследваме транскрипционната регулация на bcl-2 от NF-κB и неговото значение за ендогенната експресия на Bcl-2 в човешки ракови клетки на простатата след излагане на TNF-α.

резултатът

Идентифициране на сайта (ите) за свързване на транскрипционен фактор с NF-кВ в bcl-2 p2 промотора с помощта на рекомбинантен NF-kB1

Местоположението на мястото (местата) за свързване на транскрипционния фактор на NF-кВ в bcl-2 промоторните области беше идентифицирано чрез анализ на отпечатъка на DNase I, използвайки пречистен рекомбинантен р50 протеин (NF-kB1) (Фигура 1). Защитата беше ясно наблюдавана в един регион (сайт 1) на bcl-2 p2 промотора (Фигура 1, платно 2) и в съответствие с това наблюдение беше установено, че последователността на този регион съдържа елемент с 80% идентичност с NF- κB консенсусна последователност (Таблица 1).). Идентифициран е и по-малко убедителен втори сайт (сайт а), но в този регион е установено само лошо съгласие с консенсусната последователност (Таблица 1, наричана сайт 2). Не са наблюдавани следи в bcl-2 p1 промоторния регион (данните не са показани).

bcl-2

Анализ на DNase I на bcl-2 β2 промотора с NF-kB рекомбинантен протеин. 5 'маркираният с край р2 ДНК фрагмент се инкубира в отсъствие (път 1) или в присъствието на рекомбинантен р50 (път 2) преди разграждането на DNase. Несвързаната ДНК последователност (маркери) е в съседство с лента 1 и е използвана за локализиране на сайтове 1 и NF-κB сайта. крака. Стрелките показват местоположението на защитените региони. Авторадиографът показва един представителен експеримент

Изображение в пълен размер

Забавяне на гела и сложен анализ на свръхсместване на регулаторни области на bcl-2 p2 промотора с рекомбинантен NF-kB1 протеин. Анализирани са 33 P-маркирани двуверижни олигонуклеотидни сонди bcl-2 p2 сайт 1 (платна 4 и 5), сайт 2 (платна 6 и 7) и NF-κB консенсус (планове 1, 2, 3, 8 и 9). за способността им да образуват комплекси за забавяне на гела и свръхсмяна с рекомбинантен р50. Заешко анти-р50 антитяло (Calbiochem-Novabiochem Corp.) се инкубира с анализирания екстракт, както е посочено. Немаркираната консенсусна последователност NF-κB на двуверижния олигонуклеотид е използвана като конкурент в лента 1, а в ленти 8 и 9 е добавен несвързан немаркиран състезателен ядрен фактор на хепатоцитна конкуренция (HNF-3), за да се демонстрира специфичността наблюдаваният комплекс. Двуверижен консенсус на последователността, посочен като елемент за отговор на cAMP (CRE), също се използва за тестване на специфичността на взаимодействието. Авторадиографът показва един представителен експеримент

Изображение в пълен размер

Характеризиране на ДНК свързващи протеини в екстракти от ядрени клетки от третирани с TNF-α LNCaP или WEHI 231 клетки, които взаимодействат с предполагаемото място за свързване на bF1-2 p2 на промотора на NF-κB.

Изображение в пълен размер

Не са наблюдавани свръх изместени комплекси с анти-sp1 ирелевантно антитяло (данните не са показани). По този начин, този свръхсменен анализ с антитела против p65 и anti-p50 предоставя допълнителни физически доказателства, че bcl-2 p2 сайт 1 всъщност свързва NF-κB комплекси.

Трансактивирането на NF-κB транскрипция от bcl-2 p2 промотора се медиира от bcl-2 p2 сайта 1

Функционален анализ на предполагаеми bcl-2 p2 места на NF-kB промотора в контекста на минималния промотор. Изследваните конструкции съдържат консенсусна NF-кВ последователност (KB), bcl-2 p2 сайт 1 (сайт 1) и bcl-2 p2 сайт2 (сайт 2) двуверижни олигонуклеотиди, клонирани в pTATA минимален промоторен конструкт (виж схемата). на върха). Номерът на копието на олигонуклеотида в конструкцията е посочен в скоби в името на конструкциите. Относителните активности на конструкциите в Hela S3 клетки бяха изследвани в присъствието (+) и отсъствието (-) на екзогенно експресирани p50/p65 (NF-κB), използвайки експресионните вектори pCMVp50 и pCMVp65. Отчитат се транскрипционни дейности в сравнение с pNF-κB конструкцията (2) в присъствието на NF-κB, който е определен като рецептор с относителна активност 1.0. PRL-TK е използван за коригиране на ефективността на трансфекцията. Тези резултати са средното за три отделни експеримента и лентите за грешки показват стандартното отклонение

Изображение в пълен размер

Трансактивация на транскрипция от bcl-2 p2 промотор от NF-κB и премахване на този ефект чрез насочена към сайта мутагенеза на предполагаемия сайт 1. Конструктите p2LUC съдържат bcl-2 p2 промоторна последователност от -754 до +1, разположена директно 5 'Без промоторен ген на промотор на луцифераза (LUC) в pbasic (Promega), така че bcl-2 p2 промоторът да насочва експресията на LUC гена. Плазмидите p2M1LUC и p2M2LUC, съдържащи мутирали места 1 или 2, се генерират от p2LUC, като се използва насочения към сайта GeneEditor комплект за мутагенеза на сайта (Promega). Относителната активност на конструкциите в Hela S3 клетки се изследва в присъствието (+) и отсъствието (-) на екзогенно експресирани p50/p65, като се използват експресионните вектори pCMVp50 и pCMVp65. Отчитат се транскрипционни дейности в сравнение с p2LUC конструкцията в отсъствие на NF-κB, за което се посочва, че има относителна активност 1.0. PRL-TK е използван за коригиране на ефективността на трансфекцията. Тези резултати са средната стойност за четири отделни експеримента и лентите за грешки показват стандартното отклонение

Изображение в пълен размер

Лечение с TNF-α и експресия на Bcl-2 в LNCaP клетки на рак на простатата при човека

Повишената експресия на Bcl-2 в отговор на поемането на хормони се увеличава допълнително в присъствието на TNF-α. LNCaP човешки клетки от рак на простатата се култивират в среда, съдържаща 10% серум, изчерпан от активен въглен в присъствието (+ H) или отсъствието на (-H) хормон (0,5 nM 6α-флуоротестостерон) за една нощ преди добавянето на NF-κB и/или TNF-β инхибитори. Инхибитори (Bay 11-7082 [10 μM] и пропусклив за клетките NF-kB инхибиторен пептид [100 mg/ml]) или пропусклив за клетки NF-kB контролен пептид [100 mg/ml] се инкубират с клетки в продължение на 15 дни. мин. при 37 ° C преди добавяне на TNF-α (10 ng/ml). След това инкубацията при 37 ° С продължи още 6 часа преди клетъчен лизис и протеинов анализ (100 μg) чрез имуноблотинг срещу Bcl-2. Същият товар беше потвърден от разтвора на Ponceau S (Sigma Chemical Co) чрез оцветяване

Изображение в пълен размер

Трансактивация на транскрипцията от bcl-2 p2 промотора в LNCaP клетки в отговор на отнемане на хормони и стимулиране на TNF-α

За да се изследва ефектът на отнемането на хормона и стимулирането на TNF-α върху активността на bcl-2 p2 промотора в клетките на LNCaP, бяха проведени експерименти с преходна трансфекция с помощта на p2 промоторната конструкция (p2LUC), която съдържа bcl-2 p2 промотора с пълна дължина нагоре от мукозният луциферазен ген Фигура 7А). Транскрипционните дейности се сравняват с p2LUC конструкцията в отсъствието на TNF-α (-TNF-α) и присъствието на хормон (+ хормон), който е определен като рецептор с относителна активност 1.0.

Изображение в пълен размер

Установено е, че поемането на хормони увеличава транскрипционната активност на р2 промотора 8 пъти, а лечението на TNF-α при липса на хормон драстично засилва активността на промотора, 40 пъти над p2LUC при липса на TNF-α и в присъствието на хормонът. (Pbasic контролният вектор показа незначителна активност при всякакви условия). Тези резултати потвърждават резултатите, получени за експресия на Bcl-2 протеин в LNCaP клетки. За да се демонстрира допълнително, че трансактивацията на транскрипцията от bcl-2 p2 промотора в LNCaP клетки в отговор на поемането на хормони и стимулирането на TNF-a се медиира от NF-kB, транскрипционната активност на bcl-2 p2 промотора е оценена при тези условия . и след съвместна трансфекция на LNCaP клетки с доминираща отрицателна конструкция pCMV IκB (Upstate Biotechnology). Този вектор изразява нефосфорилируем, неразградим IκB (Фигура 7В). Резултатите, докладвани тук, показват, че трансактивацията на bcl-2 р2 промотора в TNF-a-активирани LNCaP клетки се инхибира чрез аблация на NF-kB сигнализиране. Взети заедно, тези данни предполагат преобладаваща роля за TNF-α/NF-κB пътя в транскрипционната регулация на bcl-2 в раковите клетки на простатата чрез р2 промотора.

$ config [ads_text16] не е намерен

дискусия

Материали и методи

Клетъчна култура, трансфекции и тестове за луцифераза

Незрелата В-клетъчна линия, WEHI 231, и клетъчната линия на човешкия цервикален карцином, Hela S3 (ATCC), се поддържат в модифицираната среда на Dulbecco Eagle (DMEM), допълнена с 10% фетален телешки серум и 0,45% глюкоза (Gibco Laboratories). при 37 ° C в 5% CO 2/въздух. Клетките WEHI 231 бяха допълнени с 50 цМ р-меркаптоетанол, както е описано другаде (McCormack et al., 1984). Преди лечението, WEHI 231 клетки се разреждат до плътност от 3,5 х 105 клетки/ml с прясна среда и се инкубират в продължение на 5 часа. Клетъчната линия на човешкия простатен карцином LNCaP-FGC (ATCC), посочена в този доклад като LNCaP, е култивирана в RPMI-1640, допълнена с 10% фетален говежди серум или фетален говежди серум без въглен (Gemini Bioproducts), който съдържа 10 % фетален говежди серум. 50 единици/ml пеницилин и 50 ug/ml стрептомицин.

Трансфекциите се извършват в 6-ямкови плаки, както е описано по-горе (Graham and van der Eb, 1973; Sorge et al., 1984). Трансфектираната ДНК смес съдържа 5 μg LUC плазмид на домашна муха (вижте раздела за клониране и мутагенеза по-долу) и 250 ng pRL-Tk (Promega), който служи като вътрешен контрол за ефективността на трансфекцията. pRL-TK контролира експресията на гена ренила луцифераза (RL), използвайки промотора на тимидин киназа на вируса на херпес симплекс. Където е подходящо, ДНК сместа също съдържа 100-250 ng NF-κB експресионни вектори (pCMV-p50 и pCMV-p65), контролния вектор pCMV-PA (щедър подарък от LR Faust) или IκB доминиращ отрицателен pUSE-IκB cDNA (S32A/S36A) (Биотехнология на Съединените щати). Клетъчните екстракти се приготвят 48 часа след трансфекцията и се анализират за активност на рожкови и рениларни луциферази, като се използва стоп и гло кит (Promega) съгласно инструкциите на производителя.

Клониране и мутагенеза

Екстракти от ядра и цели клетки

Ядрените екстракти се приготвят от LNCaP или WEHI 231 по същество, както е описано (Prösch et al., 2000). Клетките се третират с TNF-a (50 ng/ml) (Sigma) в продължение на 2 часа при 37 ° С през нощта, преди да се приготвят екстракти. LNCaP клетъчни екстракти се приготвят по същество, както е описано другаде (Miyake et al., 1998). За анализ на експресия на Bcl-2, клетките се инкубират в среда, съдържаща 10% серум, изчерпан от активен въглен в присъствието или отсъствието на хормон (0,5 nM 6α-флуоротестостерон) в продължение на една нощ преди добавянето на NF-кВ инхибитори и/или TNF-a. Инхибиторите (Bay 11-7082 инхибиторен пептид или NF-кВ) или контролен пептид (всички от Biomol) се инкубират с клетки в продължение на 15 минути при 37 ° С преди добавянето на TNF-a (10 ng/ml). След това инкубацията при 37 ° С продължава още 6 часа, след което клетките се лизират и анализират чрез имуноблотинг.

Имуноблот анализ

Експресията на Bcl-2 се изследва по същество, както се извършва другаде (Miyake et al., 1998). Пробите, съдържащи 100 μg протеин, се подлагат на SDS-PAGE и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. Филтрите бяха блокирани в PBS, съдържащ 5% обезмаслено мляко на прах при стайна температура за 1 час и след това инкубирани в продължение на 3 часа при стайна температура с разреждане 1: 100 на анти-bcl-2 миши моноклонални антитела (Санта Круз, Калифорния, САЩ). След това мембраните се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура с конюгирано с алкална фосфатаза антимиши IgG антитяло (Caltag) и специфични протеини се визуализират чрез колориметрична система (BCIP/NBT) съгласно инструкциите на производителя (Biorad). Същият товар беше потвърден от оцветяването на Ponceau S (Sigma Chemical Co., Сейнт Луис, Мисури, САЩ).

DNase I отпечатък, тестове за гел за електромобилност и тестове за свръхсмяна

Реакции на отпечатък с DNase I се извършват, както е описано по-рано (Briggs et al., 1986; Johnson et al., 1995). Реакциите съдържаха 1-5 ng крайно маркиран ДНК фрагмент в 100 μl реакционна смес, съдържаща 10 mM трис-хидрохлорид (рН 7,9), 50 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 1 m M DTT, 0,5 m M PMSF., 10 % (v/v) глицерол, 1 μg поли [d (IC)] и пречистен р50 (Promega). Свързването се извършва в продължение на 15 минути при 0 ° С, последвано от 2 минути и след това се спира чрез добавяне на 100 μl 1% (w/v) NaDodSO 4, 20 mM EDTA, 200 mM NaCl, съдържащ 250 μg/ml. тРНК. След това сместа се екстрахира с фенол, утае се етанол и се анализира чрез 6% уреа-акриламиден гел електрофореза и авторадиография.

Благодаря

Тази работа беше частично подкрепена от безвъзмездните средства на USPHS AI-44434, фонда на Stein Endowment и гранта за образование на Skaggs. Бихме искали да благодарим на Julia M Ruedia за техническата помощ и Carol Fedoryszyn за помощта при изготвянето на този ръкопис. PC Atterton предостави технически услуги за писане.