създаване

  • абстрактно
  • целта:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • резултатът
  • Генериране на CD44-позитивни клетъчни линии на колоректален рак
  • Клетките P6C експресират гени на щама
  • Самообновяване и диференциация на P6C клетки
  • Хромозомна нестабилност и мутации в p53 в клетки P6C
  • Холоконов ксенографтен тумор, получен от една клетка
  • Резистентност към лекарства на P6C клетки
  • дискусия
  • Принос на автора
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнително изображение S1
  • Допълнително изображение S2
  • Допълнително изображение S3
  • Допълнително изображение S4
  • Допълнително изображение S5
  • Допълнително изображение S6

абстрактно

Стволовите клетки на рака са способни да инициират и поддържат растежа на тумора. В това проучване установихме линията на стволови клетки от колоректален рак CD44 + със специален акцент върху способността му да се самообновява, повишено иницииране на тумор и лекарствена резистентност.

методи:

Пресен рак на дебелото черво и сдвоени нормални тъкани на дебелото черво са събрани от 13 пациенти, които не са били подложени на химиотерапия или лъчетерапия преди операцията. От 6 клонинги, получени от една клетка, само P6C клетъчната линия е култивирана за повече от 20 пасажа в серийна култура и са образувани високоефективни холоклони, последвани от генна експресия на стволови щамове, образуване на колонии, туморогенност и лекарствена чувствителност на клетъчната линия P6C. са били изследвани.

резултатите:

Протеинови щамове, включително c-Myc, Oct3/4, Nanog, Lgr5 и SOX2, бяха силно експресирани в клетъчната линия P6C. Oct3/4-положителните P6C клетки генерират най-вече холоклони чрез симетрично делене, докато малък брой P6C клетки генерират мерклони чрез асиметрично делене. P6C клетките стабилно експресират CD44 и имат висок капацитет да образуват туморни сфери. Едноклетъчна сфера успя да генерира ксенотрансплантатни тумори при голи мишки. В сравнение с SW480 и HCT116 колоректални карциномни клетки, P6C клетките са силно устойчиви на камптотецин и 5-флуороурацил, често използвани химиотерапевтични средства за лечение на колоректален рак.

заключение:

Разработихме линия на стволови клетки от рак на дебелото черво и ректума P6C с висок туморогенен капацитет и нормални характеристики на стволови клетки. Това ще бъде от полза за механични изследвания на раковите стволови клетки и разработването на лекарства, които са насочени специално към раковите стволови клетки.

резултатът

Генериране на CD44-позитивни клетъчни линии на колоректален рак

Събрахме пресни тъкани от рак на дебелото черво и сдвоихме нормални тъкани на дебелото черво от 13 пациенти, които не са били подложени на химиотерапия или лъчетерапия преди операцията. Тъканите се смилат в DMEM и се инкубират с 1 mg/ml колагеназа и 1 mg/ml хиалуронидаза за 1 час. Клетъчната суспензия се поставя в 25 cm 2 колби, съдържащи DMEM, допълнени с 10% FBS и ултравиолетови плаки, съдържащи DMEM, допълнени с 5% FBS. Клетките на дебелото черво и ректума от осем пациенти образуват сфери в ултратънки съдове за прикрепване (Corning, # 3262) за 25 дни (Фигура 1А). За разлика от това, при същите условия на култивиране, клетки, изолирани от сдвоени нормални тъкани на дебелото черво, не образуват никакви сфери. Вместо това, нормалните клетки на дебелото черво са претърпели ограничено клетъчно делене преди стареене (Фигура 1А). След това изолирахме отделни ракови клетки от зърната и имплантирахме тези клетки с концентрация от 0,5 клетки на гнездо в 96-гнездова плака. Четири клонинга, получени от една клетка (наречени P6C, P7C, P8C, P13C-1, P13C-2 и P13C-3) са генерирани от четирима пациенти. От тях само линията P6C е култивирана за повече от 20 пасажа в серийна култура и е образувала високоефективни холоклони 14, 15 (Фигура 1А).

90%, когато клетките се отглеждат на плаки (Фигура 1D). За разлика от тях, нивата на експресия на диференцирани чревни епителни маркери, включително CDX2, цитокератин 1 (CK1) и CK20, са ниски, когато клетките се отглеждат в сфероидни културни условия и значително се увеличават след свързването. Това предполага, че P6C клетките в сфероидите запазват недиференцирано състояние и претърпяват известна степен на диференциация при промяна на културните условия (Фигура 1D). В сравнение с клетъчната линия P6C, диференцираната колоректална карциномна клетъчна линия SW480 показва ниска CD44 експресия, висока CK20 експресия и е положителна за CDX2 експресия (Фигура 1D).

Подобреното клонално образуване е една от характеристиките на CSC. Когато 100 клетки бяха имплантирани в 6-ямкова плака, ние забелязахме, че от клетъчната линия P6C са генерирани повече клонове, отколкото от клетъчните линии HCT116 и SW480; тази разлика в броя на клонингите е значителна (Фигура 1Е). Тези данни показват, че клетъчната линия P6C е способна да се подложи на самообновяване и диференциация, като и двете са характеристики на стволови клетки.

Клетките P6C експресират гени на щама

Експресия на стволови гени в клетки P6C. (А) Имунофлуоресценция на стволови протеини в култивирани P6C клетки. Сферите от P6C се дисоциират, засяват се върху покривни стъкла и се оставят за 3 часа. След фиксиране на клетките с параформалдехид, клетките се инкубират с посочените антитела. DAPI се използва за оцветяване на ядрени броячи. Скала, 100 μm. (B) Експресия на ген на стволови клетки, открита от Western blot. Р6С клетките бяха стабилно трансфектирани с конструкцията pOct3/4 промотор-EGFP (OPG). Целият клетъчен лизат от клетки HT29, HCT116, SW480, P6C и P6C-OPG се прилага равномерно, подлага се на SDS-PAGE и се прехвърля в нитроцелулозни мембрани. След това мембраните се инкубират с посочените антитела и се визуализират с помощта на ECL системата. (C) Ефект на CD44 shRNA върху експресията на Oct3/4 в P6C клетки. Относителната активност на промотора Oct3/4 се измерва чрез интензивност на флуоресценция на GFP, както се открива чрез поточна цитометрия. P6C и родителските клетки бяха използвани като контроли. Всяка проба се извършва в три екземпляра и експериментът се повтаря три пъти. b P

Симетрично и асиметрично разделяне на клетките P6C. (А) Активиране на промотора Oct3/4 в клетки P6C и SW480. Клетките P6C и SW480 бяха стабилно трансфектирани с конструкцията pOct3/4 промотор-EGFP. Активирането на промотор Oct3/4 и експресията на CD45 се измерват чрез интензивност на флуоресценция, като се използва поточен цитометър. (B) Самообновяване на положителна P6C клетка Oct6/4. Една положителна P6C клетка от Oct3/4 се засява в 6-ямкова плака и се наблюдава под микроскоп. Правени са снимки на всеки 24 часа, за да се открие образуването на холоцен. Скала, 50 μm. (C) Асиметрично разделяне на Oct3/4 положителна P6C клетка.Мероклон от една Oct3/4 положителна P6C клетка претърпя асиметрично делене в клетки от етап 2. Снимките се правеха на всеки 24 часа. Скала, 50 μm. (D) Различни мероклони, параклони и холоклони, получени от Oct3/4 положителни клетки. Клетъчната морфология в частично положителния клонинг Oct3/4 (по-горе) показва плътна адхезия на Oct3/4 положителни клетки и спокойно взаимодействие на Oct3/4-отрицателни клетки. Два клонинга един до друг, показващи, че параклонът е Oct3/4-отрицателен, а холоклонът е Oct3/4-положителен (отдолу). Скала, 200 μm.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Самосглобяването и диференцирането са характерни черти на стволовите клетки. За да разберем ролята им в клетъчната линия P6C, имплантирахме отделни клетки P6C-OPG в 96-ямкова плака и наблюдавахме тяхното разделяне под микроскоп. Повечето oct3/4-положителни ракови клетки претърпяват симетрично разделяне, за да образуват GFP-положителни холоклонови клетки (87%), както е показано на Фигура 3В, докато само 13% от клетките P6C генерират мерклони чрез асиметрично разделяне (Фигура 3C). Малък процент (

0,5%) от Oct3/4-отрицателни клетки успяха да се диверсифицират в Oct3/4-положителни клетки, когато се засяват в ултратънки ястия (данните не са показани). Също така забелязахме, че експресията на Oct3/4 е силно свързана с клетъчната морфология. Всички параклони са Oct3/4-отрицателни, докато всички наблюдавани холоклони се състоят от Oct3/4-положителни клетки. В мероклона клетките, експресиращи Oct3/4, бяха здраво залепени, докато клетките, отрицателни за Oct3/4, бяха слабо свързани, както се наблюдава под фазов контрастен микроскоп (Фигура 3D). Тези наблюдения допълнително подкрепят хипотезата, че клетките P6C имат критични свойства за самообновяване и диференциация. В допълнение, Oct3/4 може да е маркер на колоректални CSC, които имат по-голям потенциал да се подложат на симетрично разделяне от предложеното преди 16 .

Хромозомна нестабилност и мутации в p53 в клетки P6C

Една от ключовите характеристики на раковите клетки спрямо нормалните клетки е хромозомната нестабилност, която се счита за критична за започване на туморогенеза 17; обаче, точната роля, която геномната нестабилност играе при инициирането на CSC, остава неуловима. Следователно, ние се интересувахме от изследването на геномната цялост на клетъчната линия P6C. Както е показано на фигура 4А, 73% от клетките P6C имат 59 хромозоми. Имаше едно копие на хромозоми 3, 4, 9, 13, 14 и 15 и три копия на хромозоми 7, 12, 20 и 22. Хромозомните транслокации също бяха често срещани в тази клетъчна линия заедно с хромозомни вмъквания и делеции (Фигура 4А). Тези данни показват, че клетъчната линия P6C страда от хромозомна нестабилност и анормална митоза, които са общи черти на раковите клетки.

Кариотип и мутации на p53 P6C клетки. (А) Представителен кариотип на клетките P6C. Приблизително 73% от клетките P6C имат 59 хромозоми. Всяка хромозома се оцветява с различен цвят чрез FISH анализ. (B) 72P до 72R мутация в р53 алела на P6C клетки (пасаж 120). P53 сДНК се транскрибира обратно от иРНК и се клонира в Т-светлинен вектор преди секвениране (отгоре). Мутацията от C до G е потвърдена от Chromos Map (отдолу). (C) Вмъкване на 117 bp в p53 cDNA от P6C клетки, което води до преждевременно спиране на кодон "TGA" след 25 аминокиселини. (D) p53 алели от пасаж 4 и пасаж 120 от клетки Р6С. CDNA се транскрибира обратно от тРНК и p53 генът се амплифицира чрез PCR преди вмъкване в Т-вектора. Статистическият анализ на p53 алелите беше извършен чрез секвениране на 10 до 22 конструкции от всяка проба.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Генетичната мутация на туморни супресорни гени, като p53, е тясно свързана с инициирането на рак. Чудехме се дали CSCs имат мутирал ген p53, който може да е свързан с тяхната анормална пролиферация. Генът p53 е клониран от клетъчната линия P6C и анализът на последователността разкрива, че 72P до R мутанти се появяват съответно в 60% и 67% от пасажи 4 и 120 клетки (Фигура 4В, 4D). Също така открихме вмъкване на 117 bp в p53 cDNA; това вмъкване доведе до прекъсване на 25 аминокиселини в N-края на p53 (Фигура 4С). Важно е, че открихме, че мутациите в гена p53 са сходни както в клетки с нисък пасаж (пасаж 4), така и в клетки с висок пасаж (пасаж 120), което категорично предполага, че тези мутации не се натрупват поради условията на клетъчна култура in vitro (Фигура 4D). ). Тези данни също подкрепят възможността мутациите в определени стволови клетки да доведат до появата на CSC, както вече беше предложено.

Също така определихме скоростта на пролиферация на P6C клетки в еднослойната култура, като изчислихме скоростта на клетъчен растеж. Както е показано на допълнителна фигура 5, времето за удвояване на P6C клетките е

20 часа, подобно на SW480 и HCT116 клетъчни линии (P> 0,05). Тези данни предполагат, че P6C клетките имат подобни пролиферативни свойства с диференцирани колоректални клетъчни линии на рака, когато се отглеждат в ястия с клетъчни култури.

Холоконов ксенографтен тумор, получен от една клетка

По-нататък разгледахме въпроса дали единична клетка P6C може да доведе до ксенографтен тумор, което е отличителен белег на CSC. Голи мишки се инжектират с едноклетъчни холоклони, съдържащи приблизително 500 клетки. Изненадващо, ксенографтните тумори започнаха със 100% честота (6/6). След това отделихме и трипсинизирахме тумори от голи мишки, за да регенерираме отделни вторични клонове, получени от клетки. Многократното инжектиране на вторични клонинги, приблизително 500 клетки, в голи мишки също води до 100% честота на иницииране на тумор. Тези данни също подкрепят схващането, че клетките P6C имат способността да се самообновяват и диференцират in vivo .

Едно от предимствата на линията CSC е осигуряването на идеална система за проследяване на прогресията на тумора in vivo. За тази стратегия предварително маркирахме клетките P6C-OPG с DsRed и пречистени двойно положителни клетки чрез FACS (Фигура 5А). DsRed/GFP двойно положителни холоклони бяха избрани и трансплантирани в голи мишки (Фигура 5В). Развитието на тумора се визуализира чрез флуоресцентно изобразяване на цялото тяло, както е показано на Фигура 5С. GFP имунохистохимията разкрива, че някои Oct6/4-положителни P6C клетки се диференцират в Oct3/4-отрицателни клетки в тумори на ксенографт. Колокализацията на CD44 и Oct3/4 беше открита чрез оцветяване на серийни секции. Интересното е, че CD44 и Oct3/4 двойно положителни клетки са разположени в клъстери в ксенографтни тумори, подобни на първичните ракови заболявания (Фигура 5D).

Изобразяване на тумори, получени от единичен клетъчен клон P6C. (A) DsRed белязани P6C-OPG клетки бяха сортирани по FACS. P6C-OPG клетките бяха трансфектирани с конструкцията DsRed и анализирани от FACS. GFP/DsRed двойно положителни клетки се разделят за размножаване в култури. (B) GFP/DsRed двойни положителни клонинги. DsRed беше стабилно експресиран в една клетка, получена от клона P6C-OPG. Скала, 200 μm. (C) Ксенографтни тумори, инициирани от DsRed-белязани P6C-OPG холоклони при голи мишки. Туморите бяха открити чрез флуоресцентно изобразяване на цялото тяло (in vivo FX PRO, Carestream) и бяха показани чрез относителна интензивност на флуоресценция при d 0 и 30. (D) Имунохистохимия на туморите на ксенотрансплантата. Туморите бяха фиксирани в парафин и CD44 и GFP антитела бяха използвани за откриване на експресия на CD44 и Oct3/4. Скала, 200 μm.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Резистентност към лекарства на P6C клетки

Предполага се, че CSC могат да предоставят резистентност към лекарства и да допринесат за рецидив на рака. Поради това се опитахме да отговорим на въпроса дали P6Cs са устойчиви на химиотерапевтични агенти. Камптотецин (CPT) и 5-флуороурацил (5-FU) са често използвани химиотерапевтици при лечението на колоректален рак. В сравнение с клетките HCT116 и SW480, открихме, че клетките P6C са по-малко чувствителни към CPT и 5-FU (Фигура 6А, 6В; Допълнителна фигура 6А). В допълнение към липсата на инхибиране на клетъчната пролиферация, P6C клетките са силно устойчиви на 5-FU-индуцирана апоптоза, както е показано от оцветяване с анексин V/PI (Фигура 6В, 6С; Допълнителна фигура 6В). Тъй като най-често използваните химиотерапевтици действат чрез спиране на клетъчния цикъл, ние изследвахме дали 5-FU повлиява клетъчния цикъл. За наша изненада, P6C клетките бяха по-малко чувствителни към 5-FU-индуцирана контролна точка S-G2 в сравнение с SW480 клетки в сравнение с SW480 клетки. Въпреки че спирането на клетъчния цикъл продължава 48 часа, този ефект е отслабен за 72 часа (Фигура 6D). Тези данни предполагат, че в CSC има уникален контролен пункт за клетъчния цикъл, водещ до лекарствена резистентност.

Хеморезистентност на клетки P6C. (А) Морфологично наблюдение на клетки P6C, HCT116 и SW480, третирани с 2 μmol/l камптотецин. Клетъчната морфология се наблюдава под микроскоп след 24 и 48 часа. Скала, 100 μm. (B) 5-FU индуцирана клетъчна смърт на клетки P6C и SW480. Клетките се третират с 1 ug/ml 5-FU за посочените времена и след това се трипсинизират. След оцветяване с анексин V и PI се извършва поточен цитометричен анализ. (C) Статистически анализ на 5-FU-индуцирана клетъчна смърт. Клетките P6C и SW480 се третират с 0, 1, 1 и 10 μg/ml 5-FU в посочените часове. Клетъчната смърт се изчислява като процент на PI + клетки, определен чрез поточна цитометрия. Този експеримент беше повторен три пъти. c P 18, 19, 20. Предишен доклад също показа, че неправилната експресия на гена OCT4 води до значителна чревна дисплазия 21. Трето, демонстрирахме, че мъниста или холоклони, получени от една клетка, водят до 100% честота на ксенографтен тумор при голи мишки. И накрая, и най-важното, показахме, че P6C могат да се подложат на самообновяване и диференциация. И двете функции са от решаващо значение за прогресирането на CSCs до тумора.

Принос на автора

Guan-hua RAO извършва имуноанализи и участва в установяването на клетъчна линия с помощта на Xiao-hui WANG, Jun WANG и Hai-jing JIN; Hong-min LIU проведе клетъчни изследвания, участва в клетъчна култура и подготви ръкопис; Bao-wei LI и Yan-lei YANG взеха туморни проби, извършиха изследвания на туморогенността; Jia-jie HAO и Ming-rong WANG извършиха генетични изследвания; Куан ЧЕН проектира експериментите и разработи ръкописа; и Lei DU извършват молекулярни изследвания и статистически анализи, участват в експериментален дизайн и подготвят ръкопис.

Допълнителна информация

Файлове с изображения

Допълнително изображение S1

Контрол на анти-CD45, анти-CD31 и анти-CD24 антитела.