стомашно-чревното

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • TNBS причинява колит и увреждане на паметта при мишки
  • EC нарушено учене и нарушения на паметта при мишки
  • LJ атенюира TNBS или EC-индуциран колит и увреждане на паметта
  • Съставът на чревната микробиота нарушава TNBS и EC
  • LPS, изолиран от EC ускорено увреждане на паметта при мишки
  • дискусия
  • методи
  • стъпки
  • Архив на последователността на последователностите
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация

елементи

  • Имунологична памет
  • инфекция
  • Възпалително заболяване на червата
  • микрофлора

абстрактно

Интензивните и обширни двупосочни мрежи между чревния микробиот и централната нервна система (ЦНС) се поддържат от ендокринните, нервните и имунните пътища. 1, 2 Излагането на стрес, като патогени, стимулира мозъка чрез секреция на хормони, като кортикотропин-освобождаващ фактор, чрез оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза, които нарушават чревните микробиотици, пропускливостта и бариерната функция и увеличават производството на ендотоксини, като като напр липополизахариди (LPS). 3, 4 В допълнение, тези ендотоксини, които са част от бактериалните химични компоненти, стимулират чревния имунен отговор и ограничават секрецията на невротрансмитерите серотонин и катехоламини. 5, 6, 7 Тези невротрансмитери, цитокини и хормони подпомагат комуникацията между чревната имунна система (свързана с чревния микробиот) и ЦНС и поддържат хомеостазата. 5, 6 Дисрегулирането на тези сигнали води до колит, аутизъм и затлъстяване. 8, 9

В това проучване, тъй като стресът може да индуцира нива на LPS чрез колит и тъй като LPS може да повлияе на функцията на ЦНС, ние тествахме нашата хипотеза, че индукторите на колит могат да причинят гастрит и увреждане на паметта чрез нарушаване на чревния състав на микробиотата и изследвахме дали колебанията в чревния микробиотичен състав, причинени от индуктор на колит може да потенцира колит и влошаване на паметта при мишки.

резултатът

TNBS причинява колит и увреждане на паметта при мишки

В това проучване интраректалното приложение на TNBS при мишки е причинило скъсяване на дебелото черво, повишена активност на миелопероксидазата (MPO), индуцира експресията на възпалителни маркери, включително индуцируема азотна оксидна синтаза и циклооксигеназа-2, и повишено активиране на NF-кВ в дебелото черво (Фигура ). 1а - ca допълнително изображение S1a онлайн). TNBS потиска експресията на протеини със свити ZO-1, клаудин-1 и оклузинови връзки в дебелото черво. TNBS увеличи броя на Enterobacteriaceae, особено Escherichia coli (EC,> 75% Enterobacteriaceae), но намали броя на Bifidobacteria и Lactobacilli, включително Lactobacillus johnsonii (LJ) (Фигура 1г, д). Лечението с TNBS увеличава производството на чревна микробиота LPS (Фигура 1f). Лечението с TNBS допълнително повишава нивата на LPS и TNF-α в кръвта и нивата на TNF-α в тазобедрената ампапала (Фигура 1g-i). Лечението с TNBS също значително намалява поведението при учене и памет в Y лабиринта и задачите за пасивно избягване (Фигура 1j, k). TNBS също индуцира NF-кВ активация в хипокампуса и потиска експресията на мозъчен невротрофичен фактор (BDNF) и фосфорилиране на свързващия протеин на cAMP отговор (CREB) (Фигура 11 и Допълнителна фигура S1b).

L. johnsonii (LJ) атенюира индуциран от 2,4,6-тринитробензенсулфонова киселина (TNBS) колит и нарушена памет. Поведението на обучение и памет бяха оценени в ролята на лабиринт Y ( а ). Експресията на мозъчно-извлечения невротрофичен фактор (BDNF) и активирането на ядрен фактор (NF) -KB бяха измерени в хипокампуса чрез имуноблотинг ( б ). Нивата на липополизахарид в кръвта (LPS) бяха измерени с помощта на теста Limulus ( ° С ). Нива в кръвта ( д ) и тумор хипокампален фактор на некроза (TNF) -α ( д ) са измерени чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Маркери на колит, включително съкращаване на дебелото черво ( е ), активност на миелопероксидаза на дебелото черво (MPO) ( ж ) и активиране на NF-кВ и индуцируема експресия на азотен оксид синтаза (iNOS) и циклооксигеназа (COX) -2 ( з ) и експресията на протеини с плътно свързване i) бяха измерени в дебелото черво. Стойностите показват средната стойност ± sd (n = 10). * Р

Ефекти на 2,4,6-тринитробензенсулфонова киселина (TNBS), Е. coli (EC) и L. johnsonii (LJ) върху чревния състав на микробиота при мишки. Ефект върху нивото на щам ( а ) и семейства ( б ). Съотношения протеобактерии към твърди вещества (P/F) ( ° С ), Bacteroidetes to Firmicutes (B/F) ( д ) и протеобактерии до Bacteroidetes (P/B) ( д ) са анализирани чрез пиросеквениране на бактериални 16S рРНК фрагменти. ( д ). е ) Графика на основния координатен анализ (PCoA). Графиката показва групиране между мишки, третирани само с носител (NOR), само с TNBS, само с EC, LJ в присъствието на EC (EC + LJ) въз основа на претеглен сдвоен бърз анализ на UniFrac. Ефект върху броя на Enterobacteriaceae ( ж ) и бифидобактерии + лактобацили ( з ) се измерва като се използва култура от селективна среда. Черни, сиви и бели колони в ( ж ) посочват състава на EC, K. pneumoniae и P. mirabilis. Стойностите показват средната стойност ± sd (n = 5). * Р

методи

Култура на чревни бактерии. LJ и EC, изолирани от чревна микробиота на мишка, се култивират в GAM среда (BD, Radnor, PA) и MRS (BD), BL и DHL селективна среда (Nissui Pharm, Токио, Япония). Накратко, LJ и EC се култивират в 0,5 L GAM бульон при 37 ° С (оптична плътност при 600 nm, 1,0 - 1, 2), събират се чрез центрофугиране (5000 g за 20 минути) и се промиват два пъти с физиологичен разтвор. Събраните клетки (5 х 109 CFU ml -1) се суспендират във физиологичен разтвор (за клетъчни експерименти, нагрява се при 72 ° С в продължение на 30 минути) или 1% глюкоза (за орално приложение на мишки).

За анализ на чревната микробиота чрез селективна среда, съдържанието на прясно дебело черво (

0,1 g) от всяка група се събира в стерилизирани пластмасови контейнери, внимателно се суспендира в 9 обема разредител, последователно се разрежда 10 пъти и се инокулира директно върху агарови плаки с кръвна чернодробна среда (BL, Bifidobacteria/Lactobacilli-selective среда, Nissui Pharm) и водородна сулфатна лактозна среда (DHL, Enterobacteriaceae-селективна среда, Eiken Chem, Токио, Япония). 41 агарни плаки DHL се култивират аеробно в продължение на 1 ден при 37 ° C, а плаките BL агар се култивират анаеробно в продължение на 3 дни при 37 ° C.

LJ и EC са избрани от колонии, които по същество са отгледани в BL и DHL и са идентифицирани чрез оцветяване по Gram, анализ на използването на захарта (API 50 CHL или API 20 E Kit, bioMerieux, Сеул, Корея) и 16S rRNA секвениране (ABI). 3730XL ДНК анализ). Те са депозирани в съкратения архив на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) под номера за присъединяване KY751910 и KY751911.

LPS изолация от EC. LPS се извлича, както е описано по-рано с някои модификации. Накратко, EC се култивира в триптичен соев бульон (500 ml) за 24 часа при 37 ° С и се събира чрез центрофугиране при 10 000 g за 5 минути. Пелетите се промиват два пъти в 0,15 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS, рН 7,2), съдържащ 0,15 mM CaCl2 и 0,5 mM MgCl2, суспендирани в 50 ml PBS и обработени с ултразвук в продължение на 30 минути върху лед. Ултразвукът се инкубира с протеиназа К (100 μg ml-1, Sigma, St. Louis, MO) при 65 ° C в продължение на 2 часа и след това се третира с RNase (40 μg ml-1, Sigma) и DNase (20 μg ml- 1) .1) Sigma) в присъствието на 1 μl/ml 20% MgSO 4 и 4 μl ml -1 хлороформ при 37 ° C за една нощ. Реакционният разтвор се екстрахира с еднакъв обем от 90% фенол с енергично разклащане при 65-70 ° С за 15 минути, прехвърля се в полипропиленови епруветки и се центрофугира при 8 500 g за 15 минути. Супернатантите се третират с 10 обема 95% студен етанол в присъствието на 0,5 М натриев ацетат при -20 ° С в продължение на една нощ и се центрофугират при 2000 g при 4 ° С в продължение на 10 минути. Получената пелета се суспендира в дестилирана вода, диализира се два пъти срещу двойно дестилирана вода при 4 ° С, след това се лиофилизира и се използва като LPS в този експеримент.

Клетъчна култура Caco-2. Клетките Caco-2 са закупени от Korea Cell Line Bank (Сеул, Корея) и са култивирани при 37 ° C в атмосфера от 5% CO 2 - 95% въздух в DMEM (Sigma), съдържащ 10% фетален говежди серум и 1% антибиотик- За да се измери ефектът на LJ върху експресията на здраво свързани протеини in vitro, клетките се третират със 100 ng ml-1 фракция LPS в изпражненията в присъствието или отсъствието на LJ в продължение на 24 часа и нивата на експресия на фиксирани протеини в техните клетки. лизатът се измерва чрез имуноблотинг.

Животните. Мъжки ICR мишки (25-27 g, на 5 седмици) са доставени от RaonBio. (Gyeonggi-do, Корея). Всички мишки бяха поставени в телени клетки при 20-22 ° C и 50 ± 10% влажност, хранени със стандартна лабораторна чау и вода ad libitum. Мишките бяха използвани в експерименти след аклиматизация за повече от 1 седмица. Всяка група във всички експерименти се състои от 10 мишки.

Всички експерименти с животни са одобрени от Университетския комитет по грижа и използване на лабораторни животни в Kyung Hee и са извършени в съответствие с Насоките на университета Kyung Hee за грижа и използване на лабораторни животни (IRB номер KHUASP (SE) -15-092).

Подготовка на експериментални мишки с колит. За да се приготвят мишки с индуциран от TNBS колит, 2,5% (w/v) разтвор на TNBS (100 μl, разтворен в 50% етанол) се инжектира интраректално в дебелото черво на мишки под етерна етерна анестезия с етер 43 (Допълнителна фигура S6a). За да се разпредели TNBS изцяло в дебелото черво, мишките се държат във вертикално положение в продължение на 30 s след третиране с TNBS. Нормалната контролна група се лекува с физиологичен разтвор вместо TNBS. Мишките бяха убити 24 часа, 8-мия ден и 15-ия ден след третиране с TNBS.

За приготвянето на EC-индуциран колит, на мишките се прилага перорално ЕС суспензия (1 × 10 9 CFU, суспендирана в 100 μl 1% глюкоза) веднъж дневно в продължение на 5 дни (допълнителна фигура S6b). Нормалната контролна група се лекува с 1% глюкоза вместо EC. Мишките бяха убити 24 часа, 8-мия ден и 15-ия ден след лечението с ЕК.

За приготвянето на LPS-индуцирано увреждане на паметта, на мишките се прилага интраперитонеално LPS разтвор (8 μg kg -1, разтворен във физиологичен разтвор) веднъж дневно в продължение на 10 дни (допълнителна фигура S6c). LPS е изолиран от EC. Нормалната контролна група се лекува с 1% глюкоза вместо EC. Мишките бяха убити 48 часа след последното приложение на LPS лечение.

Задача за пасивно избягване. Задачата за пасивно избягване беше изпълнена в акрилна кутия с две отделения, свързана с осветено отделение (20 × 20 × 20 cm) към тъмно отделение (20 × 20 × 20 cm) чрез входен отвор (5 × 5 cm) според метода на Jung et al. 44 Накратко, в опита за придобиване на мишка беше поставена в осветеното отделение на 1-ви, 8-ми и 15-ия ден след третиране с TNBS, EC или неговия LPS и, когато мишката влезе в тъмната камера, токов удар от 0,3 mA за 2 s е дадено чрез подови решетки. Проба за задържане беше извършена 24 часа след пробата за придобиване и беше измерено времето на латентност за повторно влизане в тъмната камера.

Задача Y-лабиринт. Y-лабиринтът се изпълнява в трираменен хоризонтален лабиринт (дълъг 40 cm и широк 3 cm с високи 12 cm стени), в който раменете са разположени симетрично под ъгъл 120 ° един от друг, съгласно метода на Jung et ал. 44 Лабиринтният под и стените са направени от тъмна непрозрачна поливинилова пластмаса. Мишка първоначално беше поставена в рамките на едно рамо 1-ви, 8-ми и 15-и ден след лечение с TNBS, EC или неговия LPS, като последователността (т.е. ACABC и т.н.) и броят на въвежданията в рамото бяха записани автоматично за всяка мишка за 8 мин. Действителната редуване беше дефинирана като влизане във всичките три рамена при последователни избори (т.е. ABC, CAB или BAC, но не ABA). Лабиринтните ръце бяха добре почистени между задачите, за да се премахнат остатъчните миризми. Редуването (%) беше посочено, както следва: редуване (%) = [(брой редувания)/(брой на общите влизания в рамото - 2)] × 100. Броят на влизанията в рамото служи като индикатор за двигателната активност.

Анализ на MPO активност. Дебелото черво на мишка се хомогенизира в 10 m М калиев фосфатен буфер (рН 7.0), съдържащ 0.5% хексадецил триметил амониев бромид и се центрофугира в продължение на 10 минути при 20 000 g при 4 ° С. 45 Супернатантата (50 μl) се добавя към реакционната смес (0,1 m MH202 и 1,6 m М тетраметилбензидин), инкубира се при 37 ° С в продължение на 2 минути и след това периодично се проследява абсорбцията при 650 nm в продължение на 5 минути. MPO активността беше изчислена като количеството ензим, разграждащо 1 μmol ml -1 пероксид, и изразено в единица на mg протеин.

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ и имуноблотинг. Дебелото черво на мишката или хипокампусът се хомогенизира в лизисния буфер RIPA, съдържащ 1% коктейл инхибитор на фосфатаза и 1% коктейл инхибитор на протеаза върху лед и се центрофугира при 15 000 g при 4 ° С в продължение на 15 минути. Култивираните Caco-2 клетки се хомогенизират в RIPA лизисен буфер, съдържащ 1% коктейл инхибитор на фосфатаза и 1% коктейл инхибитор на протеаза върху лед. Нивата на цитокините в супернатантите са измерени с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен набор за анализ (Ebioscience, Atlanta, GA).

За имуноблотинг, супернатантите на дебелото черво и култивираните клетъчни хомогенати се подлагат на SDS-полиакриламидна гел електрофореза и се прехвърлят в нитроцелулозната мембрана. 45 протеини бяха сондирани с антитела, открити с конюгирани с пероксидаза хрян вторични антитела и визуализирани с ECL комплект за откриване.

Анализ на Limulus амебоцитен лизат. Съдържанието на кръв и фекални ендотоксини се определя с помощта на диазо-куплирани лимулни амоебоцитни лизатни анализи (Cape Cod, E. Falmouth, MA), съгласно метода на Kim et al. 41 Накратко, за определяне на концентрацията на ендотоксин в кръвта, плазмата се разрежда в безпирогенна вода 10 пъти, инактивира се при 70 ° С в продължение на 10 минути и след това се инкубира с limulus амебоцитен лизат в продължение на 30 минути при 37 ° C. Добавянето на реагенти доведе до образуване на пурпурно производно, което поглъща светлина при 545 nm.

За определяне на концентрацията на фекален ендотоксин, 20 mg изпражнения от дебелото черво се поставят в 50 ml PBS в безпирогенна епруветка и се обработват с ултразвук за 1 h върху лед. 41 След центрофугиране при 400 g в продължение на 15 минути, горните 30 ml се събират, стерилизират се чрез филтриране през 0,45 μm филтър, последвано от повторно филтриране през 0,22 μm филтър, и инактивиране за 10 минути при 70 ° C. Филтрираният ултразвук се използва за определяне на ендотоксин.

Статистически анализ. Данните са посочени като средна стойност ± sd Статистическият анализ на данните е извършен с дисперсионен анализ и тест на Дънкан. Разлики с P