чрез

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Проектиране и производство на TRAIL слети протеини
  • Целево антиген-специфично свързване на scFv-scTRAIL
  • Целева индукция на антиген-ограничена клетъчна смърт от scFv - scTRAIL
  • TRAIL-R2-медиирана индукция на scFv-scTRAIL апоптоза
  • Серумен полуживот scFv - scTRAIL
  • Туморни ефекти върху човешки карциноми на дебелото черво при голи мишки
  • дискусия
  • Терминологичен речник

елементи

  • рак
  • фармакодинамика
  • фармакокинетика
  • Рекомбинантна протеинова терапия

абстрактно

Основното

Наскоро е описана едноверижна TNF молекула, състояща се от три TNF мономера, слети с къси пептидни линкери, която показва повишена стабилност и антитуморна активност. Предложихме аналогичен вариант на единична полипептидна верига TRAIL (scTRAIL), която беше използвана за конструиране на слят протеин scFv-scTRAIL за насочване на тумори. Сравнихме биологичната активност на този слет протеин с нецелеви scTRAIL в in vitro и in vivo туморни модели. Тук ще покажем, че scTRAIL слетият протеин, насочен към туморния антиген, показва по-висока апоптотична активност срещу scTRAIL in vitro, с преобладаващия ефект на TRAIL-R2 сигнализиране върху Colo205 клетки на карцинома на дебелото черво. In vivo проучвания в модел на ксенотрансплантат на тумор на мишка потвърждават значително по-висок отговор на специфичния за ErbB2 туморен scTRAIL слят протеин.

резултатът

Проектиране и производство на TRAIL слети протеини

За да създадем едноверижна TRAIL молекула, ние следвахме принципа на проектиране, описан за scTNF 20 и ковалентно слети три TRAIL мономера, всеки състоящ се от извънклетъчния домейн на TRAIL (aa 95-281) чрез два пептидни линкера, съдържащи четири повторения на GGGS последователността. (Фигура 1а). Добавен е N-крайният FLAG етикет за улесняване на пречистването и анализа. След това, чрез допълнително сливане на N-края на едноверижен фрагмент от антитела (scFv), разпознавайки FRP5 епитопа в извънклетъчния домейн на ErbB2, 21, ние създадохме специфичен за ErTB2 scTRAIL слят протеин (Фигура 1а).

Биохимичен анализ на scTRAIL и scFv - scTRAIL. а ) Схема на scTRAIL слетите протеини, използвани в това проучване. L, водещ пептид; scFv, човешки ErbB2-специфичен фрагмент от едноверижно антитяло; F, маркировка FLAG; ПЪТ, човешки ПЪТ (aa 95–281). ( б ) Пречистеният scTRAIL (път 1) и scFv-scTRAIL (път 2) се анализират чрез SDS-PAGE (10%, редуциращи условия), последван от имуноблот анализ (вляво, 250 ng протеин/лента) или оцветяване със сребро (вдясно, 1 μg протеин)./бар). За имуноблотинг бяха използвани анти-FLAG M2 моноклонално антитяло и конюгирано алкална фосфатаза вторично антитяло. ( ° С ) Вариантите на TRAIL се разделят чрез гел филтрация върху колона BioSuite250. Пунктираните линии показват времето на задържане на стандартите за молекулно тегло на апоферитин (443 kDa), β-амилаза (200 kDa), говежди серумен албумин (66 kDa) и карбоанхидраза (29 kDa). Събраните фракции се анализират чрез имуноблотинг, както в б . За scTRAIL фракции 1-9 (всяка втора фракция; първа част), фракции 11-16 (втора част) и фракции 19-26 (всяка втора фракция; трета част) бяха имуноблотирани. За scFv-scTRAIL фракции 8 до 24 бяха имуноблотирани

Изображение в пълен размер

Както scTRAIL, така и scFv-scTRAIL се пречистват чрез афинитетна хроматография върху моноклонална М2 анти-FLAG агароза от супернатанта на стабилно трансфектирани клетки HEK293 с добив от около 1 mg протеин на литър супернатант на клетъчна култура. Имуноблот анализ и SDS-PAGE (Фигура 1b) на пречистения протеин показват отделни протеинови ленти с молекулно тегло -70 kDa за scTRAIL и

100 kDa за scFv-scTRAIL, което съответства на очакваните изчислени молекулни тегла съответно от 71 и 98 kDa. Анализът на гел филтрация показва мономерната организация на двата варианта на scTRAIL, съответстващи по отношение на остатъка TRAIL, на нековалентно сглобения тример на конвенционалната рекомбинантна молекула TRAIL (Фигура 1в). Молекулните тегла, получени от SEC, са малко по-ниски в сравнение с теглото, получено от SDS-PAGE (Фигура 1b), което не е резултат от разграждане, както е потвърдено чрез имуноблот анализ на обединените фракции (Фигура 1c). В препарата scTRAIL малката фракция, елуирана в SEC с очевидно по-високо молекулно тегло, т.е. потенциално съдържаща агрегирани комплекси, не показва непропорционално висока биологична активност, както е установено при сравняване на цитотоксичната активност на фракции 2 и 15, като се вземе предвид относителният протеин суми (данните не са показани).

Целево антиген-специфично свързване на scFv-scTRAIL

За да се анализира специфичното свързване на scFv-scTRAIL с ErbB2-положителни клетки, беше извършен анализ на поточна цитометрия. Анализът на експресията на ErbB2 потвърждава умерено спрямо ниско ниво на експресия за клетки на Colo205 на дебелото черво и HT1080 фибросаркомни клетки (Фигура 2а), в сравнение с SKBR3 клетки, за които е известно, че силно експресират ErbB2 протеин (данните не са показани). Инкубацията на клетки Colo205 и HT1080 със слетия протеин разкри специфично свързване с ErbB2-положителни клетки (Фигура 2а и b) в сравнение с инкубация с нецелеви scTRAIL, което води до слаб флуоресцентен сигнал, или чрез анти-TRAIL откриване (Фигура 2а ) или с антитела срещу FLAG (данните не са показани). Тъй като свързването на хомотримерен FLAG-маркиран TRAIL показва подобни слаби сигнали (данните не са показани), това може да отразява ниски нива на експресия на TRAIL рецептор (TRAILR) върху изследваните целеви клетки и/или недостатъчна чувствителност на FACS анализите. ЕрбВ2-специфичното свързване се потвърждава, използвайки сливане на TRAILR1 и R2-Fc протеини за откриване на свързване на scFv-scTRAIL към целеви клетки (Фигура 2b) и конкуренция с анти-ErbB2 антитела (FRP5). Това доведе до почти пълно инхибиране на свързването на scFv-scTRAIL към ErbB2-положителната клетъчна линия (Фигура 2b).

Изображение в пълен размер

Серумен полуживот scFv - scTRAIL

За оценка на фармакокинетичните свойства на scFv-scTRAIL в сравнение с scTRAIL, серумни проби бяха събрани след интравенозно (iv) инжектиране на 400 pmol на отделни мишки Balb/c. И в двата случая относителните серумни концентрации, начертани във времето, са добре адаптирани към двуфазната експоненциална регресионна крива на спад. В рамките на 20 минути след инжектирането и двата варианта на TRAIL показват сходна кинетика със серумен полуживот ∼ 35 минути (t 1/2 α). По-късно се установява лека, но значителна разлика в бионаличността с полуживоти (t ½ β) от 160 и 124 минути и AUC 11 191 и 8125 за scFv-scTRAIL и scTRAIL (Фигура 5а). По този начин, специфичният за ErbB2 синтетичен протеин се задържа по-ефективно в кръвния поток, което може да повлияе положително на терапевтичната активност.

Изображение в пълен размер

Туморни ефекти върху човешки карциноми на дебелото черво при голи мишки

В заключение, нашите данни предоставят доказателство, че могат да се генерират биоактивни едноверижни сливащи протеини TRAIL. Освен това, сливането с специфично за целта scFv антитяло води до зависещо от целта увеличение на TRAIL-медиираната цитотоксичност in vitro, вероятно поради ефективното активиране на TRAIL-R2, и подобрява антитуморалната активност in vivo. Съответно, тази дизайнерска концепция представлява обещаваща стратегия за подобряване на антитуморалното действие на TRAIL и за свеждане до минимум на потенциалните нежелани нецелеви действия върху нормалните тъкани.