елементи

абстрактно

резултатът

Пациентите с холестаза показват повишени серумни нива на ATX

Пациентите с PBC и PSC са имали повишена ATX активност в сравнение със здравите контроли (10, 2 ± 4, 4 срещу 7, 3 ± 3, 4 срещу 2.8 ± 1.4 nmol-1 min-1 при пациенти с PBC, PSC и контроли, P −1 min −1, P 1 min-1, P 1 min-1, P 1 min-1 при мъже, P = 0.01) и е свързано с възрастта (r = 0, 31, P = 0, 012). И в двете холестатични групи, анализирани поотделно, активността на ATX не зависи от възрастта и пола, въпреки че пациентите с цироза са изключени (допълнителна фигура 1). Когато обаче анализирахме и двете холестатични групи заедно, активността на ATX се повишава при жените (9, 6 ± 4, 4 срещу 7, ± 3, 5 nmol ml-1 min-1 при мъжете) и зависи от възрастта на пациента ( r = 0, 258, P

автотаксин

ANOVA анализ. Данните са представени в графика с мустаци, със средни стойности, посочени с централна линия.

Изображение в пълен размер

Серумните нива на автотаксин са свързани с тежестта на чернодробното заболяване

В PBC групата активността на ATX е по-висока при пациенти с по-голяма продължителност на заболяването (r = 0, 327, P 1 min. -1 в стадия на некроза, P 1 min-1 в стадии A, B и C в Child-Pugh етап; P> 0,05 за всички, Допълнителна фигура 3А), AUC анализ идентифицира серумната ATX активност като важен предиктор за цироза (AUC = 0,7; 95% CI = 0,60-0,79; P

Коефициенти на корелация на Pearson между активността на ATX и продължителността на чернодробно заболяване при пациенти с ( A ) PBC и ( Б. ) PSC. Сравнение между активността на ATX при пациенти с цироза и некроза с ( ° С ) PBC и ( д ) PSC. АНОВА. Данните са представени като средни стойности ± SD.

Изображение в пълен размер

В допълнение, нивата на ATX са значително корелирани (всички P 1 min - 1, P

Коефициенти на корелация на Pearson на ATX активност и MELD резултати при пациенти с ( A ) PBC и ( д ) PSC. ( Б. ) Оценка на риска от Mayo за PBC и ( Е. ) Резултат от Mayo Risk за PSC. ( ° С ) Сравнение на активността на ATX между респондентите от UDCA и неотговорилите в групата PBC. АНОВА. Данните са представени в графика с мустаци, със средни стойности, посочени с централна линия.

Изображение в пълен размер

По същия начин, в групата на PSC, активността на ATX е свързана с продължителността на заболяването (r = 0, 204, P = 0,03; Фиг. 2C) и е значително по-висока при пациенти с цироза, отколкото при пациенти без цироза (9, 3 ± 3, 8 срещу 6,6 ± 3,0 nmol ml). -1 мин -1, P 1 min-1 в класове A, B и C в клас Child-Pugh). P> 0,05 за всички, допълнителна фигура 3В). AUC анализът идентифицира серумната ATX активност като важен предиктор за цироза при пациенти с PSC (AUC = 0,734; 95% CI = 0,63-0,83, P -1 мин -1). P -1 min-1, с чувствителност 76,2% и специфичност 68,0% (фиг. 4В). Регресионният модел на Cox за повишени стойности на ATX разкрива коефициент на риск (HR) от 3, 87 (P

Сравнение на активността на ATX между пациенти, които са достигнали крайната точка по време на проследяването (претърпели са чернодробна трансплантация или са починали) и пациенти, които са били живи в края на проучването в групи ( A ) PBC и ( ° С ) PSC. Работни характеристики на приемника (ROC) под кривата (AUC) при пациенти с ( Б. ) PBC и ( д ) PSC.

Изображение в пълен размер

В нашето проучване серумният ATX не е свързан само с индексите за удовлетвореност на пациентите, но е свързан и с няколко лабораторни параметъра. Наблюдавахме значителни корелации с нивата на ALP и в двете групи и с нивата на AST в групата на PSC. По-високите нива на ATX корелират с по-лошата чернодробна функция (по-ниски нива на албумин и в двете групи и по-високи стойности на INR при пациенти с PSC) и по-нисък брой тромбоцити при PSC и концентрации на хемоглобин в двете кохорти. Освен това активността на ATX значително корелира с резултатите от MELD и в двете групи. Интересното е, че когато анализирахме отделно некроза и пациенти с цироза, повечето асоциации остават значими при пациенти с ранен стадий на чернодробно заболяване, но не и при пациенти с цироза. Това наблюдение предполага, че ATX е ценен показател за увреждане на черния дроб дори при пациенти без цироза. Ензимната активност обаче е по-висока и при пациенти с цироза и с по-голяма продължителност на заболяването и в двете групи. И накрая, AUC анализът идентифицира серумния ATX като важен показател за цироза както при пациенти с PSC, така и от PBC. Единственото изключение беше липсата на статистическа значимост по отношение на оценката на Child-Pugh, изчислена за пациенти с цироза, което може да се дължи на малкия брой индивиди във всеки клас.

Преди това нивата на ATX иРНК са били измервани в различни тъкани и органи, включително мозъка, мастната тъкан, белите дробове, черния дроб, червата, бъбреците, яйчниците и високите ендотелни венули. Въпреки това източникът на циркулиращ протеин при нормални условия не е установен 19. Неотдавнашно проучване показа, че чревните ентероендокринни клетки могат да бъдат важен източник на серумна ATX активност при мъже с холестаза 20. In vitro експресията на ATX може допълнително да бъде индуцирана от цитокини като TNF чрез активиране на NF-kb пътя 21. В допълнение към повишената експресия, повишените нива на ензимите могат да бъдат резултат от намаленото елиминиране на циркулацията. При мишки е доказано, че радиоактивно маркираният ATX се отстранява до голяма степен от циркулацията от черния дроб с полуживот от няколко минути. Смяташе се, че ATX се отстранява от плазмата чрез улавяне на рецептори върху ендотелните клетки на чернодробния синус, които също участват в чернодробната фиброза 22. За разлика от това, ATX също е бил повишен в черния дроб на плъх 21. Ефектът на бъбречната дисфункция върху циркулиращите нива на ATX е малко вероятно, тъй като серумният креатинин не е корелиран с нивата на ATX в нашите кохорти.

Установено е също, че експресията на ATX се засилва при различни злокачествени заболявания, като лимфом, злокачествен меланом и рак на гърдата 23. Тъй като LPA насърчава развитието и прогресията на тумора, се предполага, че повишената експресия на ATX може да доведе до хепатоцелуларен карцином 24. Наскоро обаче се доказа, че експресията на ATX е сравнима в хепатоцелуларната карциномна тъкан и околотуморната фиброзна тъкан, а нивата на ATX в системната циркулация не се променят след радиочестотна аблация на тумора 25. Поради много ниската честота на хепатоцелуларен карцином при пациенти с PBC и PSC, не успяхме да анализираме ефекта на HCC върху нивата на ATX в нашите кохорти.

Повишен серумен ATX е установен и при пациенти с чернодробни заболявания като хронична инфекция с хепатит С 26 и свързана с HCV фиброза и цироза 8, 27. Нашето проучване разширява тези наблюдения, като демонстрира, че циркулиращите нива на ATX са повишени при пациенти без цироза и цироза с хронична холестаза. Това откритие е особено важно при пациенти с интрахепатална холестаза по време на бременност, при които липсва хронично чернодробно увреждане, но нивата на ATX са силно повишени 12 .

Нашето проучване има определени ограничения. Данните са получени от клинично проучване, което не ни позволява да дефинираме точните молекулярни механизми, регулиращи експресията на ATX при холестатични пациенти. Освен това проучването се отнася до полски индивиди и нашите констатации със сигурност изискват проверка в други групи. Нашите открития се фокусират върху краткосрочната и обща (но не свързана с черния дроб) преживяемост. И накрая, използваните инструменти за качество на живота не са специално предназначени за употреба при пациенти с PSC.

И накрая, нашето проучване предоставя нови клинични доказателства за сърбежната роля на оста ATX/LPA в патогенезата на холестатичния сърбеж. Използването на валидирани въпросници HRQoL ни предостави уникалната възможност да идентифицираме основните връзки между повишената активност на АТХ и други симптоми, свързани с холестазата, като умора и когнитивно-емоционален спад. Следователно ATX инхибиторите или LPA рецепторните блокери могат да бъдат използвани като терапевтични средства при лечението на сърбеж, както и на други инвалидизирани симптоми, свързани с хронична холестаза. В допълнение, активността на ATX корелира с тежестта на холестатичното чернодробно заболяване, измерено както от клиничните, така и от лабораторните параметри, както и от рисковия рейтинг на Mayo. И накрая, ATX е важен предиктор за чернодробна смърт и трансплантация. Тези открития не пречат на ключовата роля на съществуващите клинични параметри, но предполагат, че ATX може да бъде друг ценен индикатор за увреждане на черния дроб и нов прогностичен маркер при хронични холестатични състояния.

методи

пациенти

В това проучване на напречното сечение включихме две независими потенциални кохорти от кавказки пациенти, диагностицирани с PBC и PSC. Тези лица са били наети в два центъра: Чернодробното отделение, Померанския медицински университет в Щецин и Катедрата по черен дроб и вътрешни болести, Катедра по обща, чернодробна трансплантация и хирургия на Медицинския университет във Варшава от септември 2009 г. до октомври 2014 г. В допълнение, кръвни проби от 109 здрави кавказки индивиди (мъже/жени: 51/58, средна възраст: 42,6 ± 11,5 години), взети в университета в Ерланген-Нюрнберг, служат като контрол за серумната активност на ATX и общите нива на жлъчните киселини. Писмено информирано съгласие беше получено от всеки обект, включен в изследването. Протоколът за изследване е одобрен от Комитета по етика на Померанския медицински университет и е в съответствие с етичните насоки на Декларацията от Хелзинки от 1975 г. (6-та ревизия, 2008 г.). Изследването е проведено съгласно изявлението STROBE (Подобряване на докладите от наблюдателни проучвания в епидемиологията).

PBC група

Проучени са сто и осемнадесет пациенти с PBC (мъже/жени: 9/109; средна възраст: 57,7 ± 11,4 години). Петдесет и трима (46,1%) пациенти с PBC са имали чернодробна цироза, потвърдена или хистологично, или чрез образни техники (компютърна томография или коремна ехография). Както е показано в таблица 4, пациентите с PBC имат значително повишени холестатични параметри и леко повишени трансаминази. При пациенти с цироза 29 (54,7%) са от групата на Child-Pugh клас A, 18 (34,0%) са от клас B-Child-Pugh и 6 (11,3%) са от клас C според Childa-Pugha . група. Петдесет и три (49,5%) пациенти с PBC не са отговорили на UDCA съгласно определението в Барселона 32 (данни за отговор на UDCA са налични при 107 пациенти). Неотговарянето на UDCA е свързано с наличието на цироза (chi 2 = 8, 5, P = 0, 004), оценка по Child-Pugh (7, 2 ± 1, 6 точки при неотговарящи пациенти спрямо 6, 1 ± 1, 4 точки при респондентите, P = 0, 02) и оценка на риска от Mayo (6, 3 ± 1, 5 точки за неотговорилите срещу 5, 5 ± 2, 0 точки за респондентите, P = 0, 03). Установена е и слаба връзка между отзивчивостта на UDCA и клас Child-Pugh (chi2 = 5, 7, P = 0,05). Неотговорилите на UDCA не се различават от отговарящите на UDCA по отношение на пол или MELD резултат (данните не са показани).

Маса в пълен размер

PSC Group

Проучени са сто и петнадесет пациенти с PSC (мъже/жени: 75/40; средна възраст: 35,4 ± 13,3 години). Диагнозата на свързания с IgG4 холангит беше отхвърлена въз основа на серумните нива на IgG4. Както се очакваше, пациентите с PSC са по-млади от пациентите с PBC и включват повече мъже. Тридесет (26,1%) пациенти с PSC също са диагностицирани с цироза: 16 (53,3%) са били от група А по Child-Pugh, 12 (40%) са от клас B и 2 (6, 7%) . ) са били в група С от класа Child-Pugh. Параметрите на холестазата бяха повишени, а оценките за MELD и оценките за риск от Mayo при пациенти с PSC бяха ниски. Тези данни са обобщени в таблица 4.

Броят на пациентите, лекувани в нашите институции през периода на изследване, определя размера на групите. Потенциалното объркване или модификаторите на ефекта са изключени доколкото ни е известно: никой от включените пациенти не е имал други състояния, които биха могли да повлияят значително HRQoL, като декомпенсиран захарен диабет, бъбречна недостатъчност, налагаща диализа, злокачествено заболяване, сърдечна недостатъчност ≥ NYHA II, ревматоиден артрит или. Клинични данни, резултати от Mayo Risk за PBC и PSC и отговори на въпросници HRQoL бяха събрани, когато пациентите се съгласиха да участват в проучването. Липсващи данни са изброени, ако са налични. Чернодробната биохимия, ATX активността и нивата на протеини и концентрациите на жлъчни киселини бяха анализирани в серума от субекти до гладно. Пробите, принадлежащи към две холестатични групи, бяха анализирани заедно в една и съща доза от лабораторен персонал, който беше заслепен от клинични данни.

Количествено определяне на активността на ATX в серума

Кръвните проби се оставят да се съсирят, преди да се центрофугират при 4 ° C и серумът се замразява в аликвотни части при -80 ° C. АТХ активността се определя количествено в разреден серум чрез изследване на слепи клинични и серологични групи. Серумни проби бяха инкубирани с буфер, съдържащ 500 mmol/l NaCl, 5 mmol/l MgCl 2, 100 mmol/l Tris (pH = 9.0) и 0.05% Triton X-100 в продължение на 60 минути при 37 ° C. Паралелни инкубации бяха проведени в наличието и отсъствието на 1 mmol/L лизофосфатидилхолин (LPC) (14: 0). Активността на ATX лизофосфолипаза се определя чрез измерване на количеството освободен холин, установено чрез ензимен флуориметричен анализ, като се използва холин оксидаза (2 U/ml), хрянова пероксидаза (1,6 U/ml) и хомованилова киселина като субстрати за пероксидазата. След добавяне на двата ензима към буфер (състоящ се от 20 mmol/l CaCl2, 2 mmol/l HVA, 50 mmol/l 3- [N-морфолино] пропансулфонова киселина [pH = 8,0) и 0,1% Triton X-100), увеличаването на флуоресценцията се наблюдава при 37 ° C на анализатор NOVOstar (възбуждане 320 nm и емисия 405 nm; BMG Labtech GmbH, Офенбург, Германия). (Ендогенното) количество холин, присъстващо в пробата без добавяне на LPC, се изважда от количеството, измерено в присъствието на LPC. Дисперсията между тестовете е по-малка от 15%, а дисперсията в теста е под 10%.

Количествено определяне на ATX протеин

Съдържанието на ATX протеин в серумни проби се определя количествено, като се използва вътрешно оптимизиран ATX-специфичен сандвич ензимно свързан имуносорбентен анализ. Накратко, микротитърните плаки бяха покрити с анти-човешко ATX антитяло (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Пробите и рекомбинантните ATX стандарти (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) бяха разредени във фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ говежди серумен албумин и 0,05% Tween-20. Заловеният антиген беше открит с биотинилирани анти-човешки ATX антитела (R&D Systems, Минеаполис, MN, САЩ) и стрептавидин-хрянова пероксидаза, като се използва тетраметилбензидин като хромогенен субстрат. Наличието на билирубин и жлъчни соли в холестатичните проби не пречи на количественото определяне на ATX.

Определяне на жлъчните киселини

Кръвни проби за определяне на жлъчните киселини бяха събрани в епруветки, покрити с EDTA. Веднага след събирането плазмата се пречиства чрез центрофугиране при 4 ° С. Впоследствие към обема плазмена проба се добавя един обем мравчена киселина 0,5 М. След това пробите бяха замразени и държани при -80 ° C до анализи. Допълнителни анализи бяха извършени, както е описано подробно на други места 33, 34, 35, 36 .

Оценка на свързаното със здравето качество на живот (HRQoL)

HRQoL беше оценен както с генерични (Кратка форма на изследването на медицинските резултати-36, SF-36), така и със специфични за заболяването въпросници (PBC-40 и PBC-27) 37. Въпросникът PBC-40 съдържа 40 въпроса в следните области: умора, когнитивни, социално-емоционални, сърбеж и други симптоми, като по-високи резултати показват по-лошо HRQoL. PBC-27 е опростен въпросник за PBC 38. SF-36 е широко използван и валидиран въпросник HRQoL, който включва 36 елемента, разделени в 8 скали. Резултати могат да бъдат получени за всяка скала или могат да бъдат обобщени в 2 обобщени оценки: Обобщен резултат на психическия компонент и Обобщен резултат на физическия компонент. Резултатите варират между 0 и 100, като по-високите резултати показват по-добър HRQoL 39 .

статистика

Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (SD) за непрекъснати променливи. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера Stat-View-5 (SAS Institute, Cary, NC, US) и SPSS 20.0 (IBM Ehnigen, Германия) и включваха точния тест на Fisher и ANOVA, когато е уместно. Категоричните данни бяха сравнени с помощта на теста на Levene за равенство на дисперсии и бяха проведени както обединени дисперсии, така и t-тестове с отделна дисперсия, за да се оцени равенството на средните стойности. Анализите на корелацията бяха извършени с помощта на ранг на Spearman или корелационни методи на Pearson. Анализът на оцеляването е извършен с помощта на регресионния модел на Кокс. Смъртта и трансплантацията на черен дроб се считат за събития. Времето за проследяване беше време до смърт, чернодробна трансплантация или последен контакт с пациента. Граничните нива на ATX в серума, предсказващи чернодробна цироза и общата преживяемост при пациенти с PBC и PSC, бяха определени с помощта на анализа на работната характеристика на приемника (ROC) под кривата (AUC). Изчислени са връзките между нивата на ATX и общите съотношения на риск от оцеляване (HR). За да се идентифицират независимите взаимоотношения и да се коригират ефектите на ковариатите, бяха извършени множество анализи на линейна регресия, включващи всички параметри със значителни корелации (P